分子生物學(xué) 疾病與人類健康

分子生物學(xué)疾病與人類健康第1頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四腫瘤與癌癥良性腫瘤-----不具有侵染性惡性腫瘤-----具有侵染性,可轉(zhuǎn)移(1)蛋白酶的表達(dá)(2)腫瘤一般會分泌促血管生成素,形成大量血管,獲取營養(yǎng)(3)癌癥致死原因------營養(yǎng)耗盡,器官功能受損第2頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因與抑癌基因癌基因的激活或過量表達(dá)------致癌(顯性)抑癌基因的失活------致癌(隱性)第4頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌基因(oncogene,c-onc)控制細(xì)胞生長的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)病毒所攜帶的致轉(zhuǎn)化因子(RNA病毒----逆轉(zhuǎn)錄病毒;DNA病毒)第5頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞癌基因(celloncogene,c-onc)即原癌基因(protooncogene)：未激活的癌基因，促進(jìn)正常細(xì)胞生長、增殖、分化、發(fā)育等

v-onc與c-onc的不同V-onc無內(nèi)含子外顯子有微小差別V-onc常出現(xiàn)堿基取代或缺失等突變第6頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因家族1.蛋白激酶類:Src家族等2.生長因子類:Sis家族等3.生長因子受體類:Neu家族等4.GTP結(jié)合蛋白類:Ras家族等5.核蛋白類:Myc家族,Ros家族等6.功能未知類:bcl-1等第7頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抑癌基因(tumorsuppressorgene)正常細(xì)胞內(nèi)，抑制細(xì)胞生長，潛在抑癌作用的基因此類基因突變、缺失或失活，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物：跨膜受體、胞質(zhì)調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期因子等第8頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因和抑癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用細(xì)胞周期及其調(diào)控細(xì)胞間期(G1期、S期、G2期)和有絲分裂期兩個調(diào)控點(diǎn)：G1/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)、G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)從增殖角度，細(xì)胞可分為三類連續(xù)分裂的細(xì)胞：周期性細(xì)胞，如小腸絨毛上皮隱窩細(xì)胞休眠細(xì)胞（G0期細(xì)胞）：暫時脫離細(xì)胞周期，如肝、腎細(xì)胞終端分化細(xì)胞：如神經(jīng)、肌肉細(xì)胞第10頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四原癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用有些原癌基因是細(xì)胞周期蛋白的成員抑癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用抑制細(xì)胞周期于靜止期，并使復(fù)制不完全或受損傷的DNA不能進(jìn)入分裂期。Rb基因(第一個調(diào)控點(diǎn)G1/S)P53基因(第一個調(diào)控點(diǎn)G1/S)第12頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因惡性激活的機(jī)制原癌基因點(diǎn)突變原癌基因基因獲得外源啟動子而激活原癌基因甲基化程度降低而激活原癌基因的拷貝數(shù)增加而激活基因易位或重排使原癌基因激活第13頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第17頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第19頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第20頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四癌基因激活與腫瘤的發(fā)生腫瘤發(fā)生學(xué)說啟動階段、促癌階段、演進(jìn)階段癌基因激活與腫瘤發(fā)生Ras基因變異與腫瘤發(fā)生Myc基因變異與腫瘤發(fā)生第22頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抑癌基因失活與腫瘤發(fā)生Rb基因P53基因P16基因腫瘤發(fā)生的多基因協(xié)同學(xué)說第23頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS第24頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS獲得性免疫缺陷綜合征（AcquiredImmunodeficiencySyndrome）

一種逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的疾病第25頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS

細(xì)胞基礎(chǔ)當(dāng)疾病發(fā)展到后期出現(xiàn)另一種類型細(xì)胞數(shù)量的降低CD8+細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞發(fā)病過程中一種類型的細(xì)胞數(shù)量減少CD4+T4

輔助細(xì)胞疾病發(fā)生以前總是出現(xiàn)CD4+

細(xì)胞的數(shù)量降低認(rèn)為AIDS是一種病毒引起的傳染病第26頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四

AIDS是HIV持續(xù)性感染的結(jié)果

根據(jù)目前HIV在發(fā)展中國家的流行狀況,可以認(rèn)為HIV和它的并發(fā)癥將會伴隨我們一代人AIDS的定義

HIV感染者其每立方毫升血中CD4+細(xì)胞數(shù)量<200個.第27頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四全世界每天大約有

16,000名新的HIV感染者其中90%以上出現(xiàn)在

發(fā)展中國家

約2000名是15歲以下的兒童

在成人感染者中,40%是女性，15%是年齡在15-25歲.到1999年12月底,美國共報(bào)告AIDS患者733,374例.其中至少有430,441例已死亡.AIDS統(tǒng)計(jì)第28頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS

病毒該病毒僅在T4細(xì)胞中增殖很難培養(yǎng)

RobertGallo:從病人血激活的T4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄酶存在

引起AIDS:人T細(xì)胞白血病病毒HTLV-3LucMontagnier:淋巴結(jié)病-相關(guān)病毒（LAV）人類免疫缺陷病毒HumanImmunodeficiencyVirus(HIV)電鏡下可見HIV顆粒.中央有核外有胞膜(CDC)第29頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDSAIDS病程1.急性感染

高病毒效價

輕微臨床癥狀

CD4+細(xì)胞數(shù)下降，但可恢復(fù)

CD8+細(xì)胞數(shù)上升，也可恢復(fù)

高病毒效價(每毫升血中有1千萬個病毒體)

巨噬細(xì)胞被感染第30頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS2.過高的免疫應(yīng)答

病毒幾乎從血循環(huán)中消失

有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答

針對病毒表面或內(nèi)部蛋白的可溶性抗體出現(xiàn)大部分病毒來自于才被活化和感染的CD4+細(xì)胞(半壽期大約1天)

CD4+細(xì)胞生成來補(bǔ)償病毒引起的感染細(xì)胞被溶解和細(xì)胞毒T細(xì)胞所致的感染細(xì)胞的被破壞第31頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS3.潛伏期病毒及臨床癥狀的潛伏期

病毒持續(xù)在血管外組織存在

淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞

靜止的CD4+記憶細(xì)胞

靜止的帶有原病毒的CD4+細(xì)胞第32頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS

每天1千億個HIV顆粒

病毒的半衰期為5.7小時

每毫升血中有1千萬到1億個病毒體

少量的T4細(xì)胞被感染發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)中存在病毒第33頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS4.疾病的起始

CD4+細(xì)胞的大量減少

CD4+細(xì)胞為病毒的靶細(xì)胞

對病毒應(yīng)答的細(xì)胞被破壞:克隆清除

樹突狀細(xì)胞提呈抗原和病毒給CD4細(xì)胞

抗原表位的變異使越來越多的HIV病毒逃脫機(jī)體的免疫應(yīng)答

CD4+凋亡

HIV病毒攜帶者如果T4細(xì)胞數(shù)一直維持較高水平，將不會發(fā)展為AIDS第34頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIVandAIDS5.嚴(yán)重階段-AIDS

CD8+細(xì)胞的被破壞比CD4+更嚴(yán)重

CD4細(xì)胞的減少意味著病毒的感染不再能夠控制

當(dāng)CD4+細(xì)胞下降到每立方毫升200個以下時，病毒的滴度迅速升高，機(jī)體的免疫應(yīng)答出現(xiàn)崩潰

CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著下降

機(jī)會性感染不加干預(yù)，2年內(nèi)死亡

CD4+細(xì)胞數(shù)量的下降與臨床癥狀的出現(xiàn)有明顯的相關(guān)關(guān)系第35頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-病毒胞膜:來源于宿主兩種糖蛋白:gp160gp120andgp41gp41是一個穿膜蛋白，而gp120則在膜外側(cè)，以非共價鍵與膜相連，是一個膜外側(cè)的周圍蛋白第36頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-病毒

GAG基因群特異性抗原p17:內(nèi)表面-豆蔻酸基團(tuán)p24:核殼體p9:與RNA相連的核蛋白第37頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-病毒多聚酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)整合酶

蛋白酶

酶

POL基因第38頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-病毒第39頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒

潛伏期

特異性的破壞CD4+細(xì)胞

病毒是如何進(jìn)入細(xì)胞的?第40頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四CD4抗原輔助受體CD4+細(xì)胞HIVgp120結(jié)合CD4/輔助受體第41頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四CD4+細(xì)胞CD4抗原輔助受體第42頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-生活史CD4CD4CD4HIVCCR5CCR5趨化因子突變

CCR5macrophage第43頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV病毒進(jìn)入CD4+細(xì)胞Movie1HIV通過gp120結(jié)合CD4細(xì)胞Movie2HIV進(jìn)入CD4細(xì)胞第44頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-生活史

GAGPOLENVHIV增殖需要:逆轉(zhuǎn)錄酶

整合酶

蛋白酶

tRNA引物HIV基因HIV沒有癌基因但一直具有致癌性第45頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV-生活史HIV感染者可數(shù)年沒有臨床癥狀在臨床潛伏期期間，病毒被持續(xù)的復(fù)制和清除潛伏期

只有激活的T4細(xì)胞能夠復(fù)制病毒大部分被迅速溶解的感染T4細(xì)胞能被補(bǔ)充一些T4轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止?fàn)顟B(tài)的記憶細(xì)胞可長期存活記憶性T4細(xì)胞不能夠復(fù)制病毒巨噬細(xì)胞沒有潛伏期臨床潛伏期第46頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV感染的CD4T細(xì)胞的動力學(xué)細(xì)胞死亡

凋亡等沒有感染的激活的T細(xì)胞慢性感染的帶有原病毒的記憶性T細(xì)胞返回靜止?fàn)顟B(tài)反應(yīng)沒有感染

沒有激活的記憶性

T細(xì)胞池感染AdaptedfromSaagandKilbyNatMed5:609,1999長期存活!長期存活!細(xì)胞死亡

免疫破壞第47頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四感染擴(kuò)散HIV感染的CD4T細(xì)胞的動力學(xué)第48頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV基因組三個結(jié)構(gòu)基因開放閱讀框架編碼的小分子蛋白可刺激AIDS病人產(chǎn)生抗體

第49頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV的基因組早期TAT:轉(zhuǎn)錄的反式作用子REV:病毒蛋白表達(dá)的調(diào)控子NEF:負(fù)性調(diào)控因子晚期VIF:病毒侵襲性因子VPU:病毒蛋白UVPR:病毒蛋白R基因組RNA剪接成多個mRNA(c.f.mRNAforstructuralproteins)TAT和REV是

HIV復(fù)制的基礎(chǔ)小的非結(jié)構(gòu)性蛋白第50頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四TATRNAPolII

U3RU5WhenTATAllproteins(ENV,POL,GAG,TAT,REVetc)TAR

U3RU5TAT第51頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四REVREV調(diào)節(jié)剪接

U3RU5DNA單個剪接ENV糖蛋白基因組

RNA多個

剪接小分子蛋白(TAT,REV)REV水平高高低REV調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白與其他蛋白的比例

U3RU5第52頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四潛伏期缺乏任何激活的刺激:

內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定第53頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四潛伏期內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定可導(dǎo)致T4細(xì)胞進(jìn)入潛伏期，但細(xì)胞面臨兩個問題

被其他的HIV通過CD4抗原重疊感染

HIVHIVCD4Anti-Gp120T4細(xì)胞游離的Gp120答案:感染細(xì)胞去掉其表面的CD4抗原在細(xì)胞表面Gp120結(jié)合CD4抗原招致免疫攻擊第54頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四潛伏期NEFNEF是早期功能蛋白NEF輔助受體CD4抗原NEF結(jié)合

CD4抗原NEF引起CD4內(nèi)化和在溶酶體中消化第55頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四CD4抗原在溶酶體中消化NEFNEF溶酶體第56頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四潛伏期中斷靜止T4細(xì)胞免疫應(yīng)答抗原結(jié)合激活的T4細(xì)胞HIV產(chǎn)生HIVLTR已經(jīng)占據(jù)激活控制序列第57頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV的其他問題內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Gp120/CD4復(fù)合物將是破壞的目標(biāo)在HIV感染的CD4細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，VPU可特異性的水解CD4抗原核糖體CD4Gp160在活化的細(xì)胞中g(shù)p120將被合成第58頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四CD4+T4細(xì)胞數(shù)量不可逆轉(zhuǎn)的下降非常重要的治療階段為什么所有的

T4在消失?在早期階段，1萬個細(xì)胞中只有1個細(xì)胞被感染，而在晚期，40個細(xì)胞中就有1個被感染第59頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四感染的早期：1:10,000晚期1:40HIV能夠殺傷T細(xì)胞亞群的前體細(xì)胞

HIV還沒有溶解細(xì)胞的病毒攜帶者也能發(fā)展為AIDS為什么所有的T4細(xì)胞在消失?1.穿膜病毒出芽導(dǎo)致細(xì)胞被破壞第60頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四但合胞體不常見多數(shù)T4細(xì)胞不是

HIV+可以感染HIV陰性細(xì)胞未感染的CD4細(xì)胞Gp120陰性細(xì)胞融合CD4細(xì)胞被破壞

2.合胞體形成被感染的CD4細(xì)胞Gp120陽性為什么所有的T4細(xì)胞在消失？合胞體不具有免疫應(yīng)答功能第61頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞毒性

T細(xì)胞殺傷CD4細(xì)胞

3.細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用為什么所有的T4細(xì)胞在消失?第62頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四殺傷CD4+細(xì)胞

4.游離的Gp120結(jié)合CD4抗原，使沒有感染的T4細(xì)胞看著象感染細(xì)胞

補(bǔ)體介導(dǎo)溶解可以解釋未感染HIV的T4細(xì)胞的丟失第63頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四為什么T4細(xì)胞在消失?5.AIDS相關(guān)的抗體與激活的T4細(xì)胞表面的抗原結(jié)合6.累及T4前體細(xì)胞7.自身免疫.Gp120結(jié)合CD4抗原.CD4抗原結(jié)合MHC-II分子:MHC與Gp120有類似的序列.抗gp120抗體可以結(jié)合MHC-對于AIDS疫苗來講也是一個問題8.T4細(xì)胞的凋亡.在克服自身免疫的克隆清除的過程中T4細(xì)胞凋亡是正常的第64頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四為什么CD8+殺傷細(xì)胞在消失?在HIV感染的后期,細(xì)胞毒性T細(xì)胞消失的非常迅速這些細(xì)胞沒有CD4抗原他們沒有被HIV感染CD8+細(xì)胞的存在與病毒的控制有一定的關(guān)系在感染晚期出現(xiàn)的HIV亞型，導(dǎo)致大量的CD8+細(xì)胞凋亡細(xì)胞毒性T細(xì)胞有輔助受體CXCR4.HIV結(jié)合但不會進(jìn)入細(xì)胞從結(jié)合部位傳遞的信號，導(dǎo)致大量的

CD8+/CXCR4+細(xì)胞凋亡第65頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)合CXCR4導(dǎo)致

TNF-α在細(xì)胞表面表達(dá)?G蛋白信號?結(jié)合CXCR4導(dǎo)致

TNF-α受體II表達(dá)CD8細(xì)胞

(noCD4antigen)巨噬細(xì)胞CXCR4HIVgp120趨化因子T細(xì)胞凋亡第66頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四CD8細(xì)胞巨噬細(xì)胞CXCR4死亡CD8T細(xì)胞凋亡小體第67頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四巨噬細(xì)胞攝取CD8+細(xì)胞的凋亡小體凋亡小體在溶酶體中被消化第68頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV和自身免疫CD4抗原gp120MHCII分子Gp120和MHCII都結(jié)合CD4抗原.都有CD4的結(jié)合位點(diǎn)抗-HIV(gp120)也能結(jié)合MHCII第69頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四巨噬細(xì)胞可通過兩種途徑被感染CD4Fc受體HIVgp120結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的CD4抗原巨噬細(xì)胞通過Fc受體與抗gp120抗體病毒復(fù)合物中的抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理吞噬作用將病毒攝取HIVgp120HIV抗-gp120第70頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四巨噬細(xì)胞-TheTrojanHorse病毒可能通過精液中的巨噬細(xì)胞感染患者HIV的感染導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生

將病毒運(yùn)輸?shù)讲煌鞴?大腦)非增殖的成熟巨噬細(xì)胞可長時間持續(xù)產(chǎn)生HIV而不被病毒殺傷--沒有潛伏期血管外的巨噬細(xì)胞是HIV的儲存池第71頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四病毒的多態(tài)性RNA聚合酶II有較高的錯誤率：1:2,000-10,000HIV基因組

9749

核苷酸因此每個新病毒至少有一個堿基突變!每天有1%的病毒發(fā)生兩個堿基的突變HIV從感染患者到出現(xiàn)臨床癥狀，病毒已發(fā)生很大變化HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒用宿主細(xì)胞的RNA聚合酶II去復(fù)制它們的基因組疫苗問題第72頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四病毒的多態(tài)性感染早期:

親巨噬細(xì)胞

非合胞體誘導(dǎo)

緩慢復(fù)制感染晚期親T4細(xì)胞

誘導(dǎo)合胞體

高病毒滴度

疫苗問題第73頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四病毒多態(tài)性變化最大的蛋白是gp120

一個病人體內(nèi)病毒氨基酸序列的變化為1-6%共感染可導(dǎo)致基因重組疫苗問題疫苗問題第74頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四病毒的多態(tài)性多態(tài)性是由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對而致高突變的結(jié)果

藥物問題逆轉(zhuǎn)錄酶的變異導(dǎo)致對脫氧核苷類似物的抵抗蛋白酶的變異導(dǎo)致對蛋白酶抑制劑的抵抗藥物問題第75頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HIV感染的其他CD4-細(xì)胞

腸道和陰道的上皮細(xì)胞

大腦的內(nèi)皮細(xì)胞

腦細(xì)胞:星形膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞半乳糖腦苷脂受體第76頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抗-HIV的策略

教育性傳播非高度的傳染性

化學(xué)藥物治療突變選擇

抵抗但抑制復(fù)制

減少突變的可能性第77頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抗-HIV的策略HighlyActiveAnti-RetroviralTherapyHAART:兩種脫氧核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑Nowalso:兩種脫氧核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種非核苷第78頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抗-HIV的疫苗潛伏期

基因漂移

逆轉(zhuǎn)錄酶

RNA多聚酶

II多態(tài)性

回復(fù)突變致癌性?-LTR問題1HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒第79頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四抗體調(diào)理

(opsonizesHIVFcreceptor)問題2合胞體

細(xì)胞間傳播

(體液中的抗體無效,需要CTL)隱藏的表位疫苗可能是免疫抑制劑

(其抗體可與MHCII結(jié)合)抗-HIV的疫苗第80頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四

Willcounselingaltertheresults?問題3

Whatistheendpointforsuccessintrials-Whatarethecorrelatesofprotection?

VaccineeappearstobeHIVpositive抗-HIV的疫苗第81頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HBV與乙肝甲肝病毒------小RNA病毒其它肝炎病毒------RNA病毒乙肝病毒-----DNA病毒有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA分子.第82頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四HBV的復(fù)制----非半保留復(fù)制DNA--修復(fù)--轉(zhuǎn)錄RNA--逆轉(zhuǎn)錄cDNA-雙鏈DNA第83頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四一、基因治療的概念

基因治療（genetherapy）——就是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。對象：體細(xì)胞生殖細(xì)胞第84頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四二、基因治療的必要條件發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行遺傳操作第85頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四理想的基因治療還必須：外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞外源基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存留導(dǎo)入基因能適量表達(dá)導(dǎo)入基因的方法及載體對宿主細(xì)胞安全無害第86頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四三、基因治療的主要內(nèi)容或策略㈠基因標(biāo)記(genelabeling)Neo基因，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體㈡基因置換（基因矯正）定位重組或同源重組糾正缺陷基因或異常序列第87頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四㈢基因添加（基因增補(bǔ)）導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因?qū)胝５幕蜓a(bǔ)償缺陷基因的功能導(dǎo)入新的基因，利用表達(dá)產(chǎn)物治療第88頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四㈣基因干預(yù)(geneinterference)指采用特定的方式抑制某個基因的表達(dá)，或者通過破壞某個基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。(mRNA,DNA)導(dǎo)入寡核苷酸抑制內(nèi)源基因的表達(dá)反義核酸封閉基因表達(dá)核酶裂解特異的靶mRNA第89頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和

靶細(xì)胞第90頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四基因治療的基本方式：體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因

體內(nèi)法invivo體細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療

回體法exvivo第91頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四基因轉(zhuǎn)移的方法：生物學(xué)方法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，單純皰疹病毒載體非生物學(xué)方法脂質(zhì)體，直接注射，受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，其它方法第92頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四一、基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法㈠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)將病毒前DNA經(jīng)適當(dāng)改造并插入質(zhì)粒后構(gòu)建而成5′LTR/3′LTR包裝信號（ψ序列）Neo基因/Ampr酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）第93頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四第94頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四包裝細(xì)胞(packagingcell)將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白。NIH/3T3三代包裝細(xì)胞：ψ—2PA317ψCRIP第95頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，載體轉(zhuǎn)錄出病毒基因組的部分序列、標(biāo)記基因、外源基因，被包裝成病毒顆粒。缺陷型的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒一過性感染病毒滴度106CFU/ml以上第96頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)：缺陷型的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞RNA進(jìn)入靶細(xì)胞后，變成前病毒并整合到宿主細(xì)胞的染色體上，可穩(wěn)定表達(dá)只能感染處于增殖期的細(xì)胞第97頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四安全性問題逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的可能性污染的可能性逆轉(zhuǎn)錄病毒在靶細(xì)胞基因組上的整合破壞細(xì)胞正常生長的必須基因/抑癌基因LTR激活原癌基因染色體重排激活原癌基因第98頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四二、基因轉(zhuǎn)移的非生物學(xué)方法㈠脂質(zhì)體㈡直接注射㈢受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)㈣其它方法第99頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四㈠脂質(zhì)體(liposome)脂質(zhì)體是由脂類形成的一種可以高效包裝DNA的人造單層膜，是一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球。其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，二者易于融合，DNA由于細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。第100頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn)：與體細(xì)胞相容，無毒性和免疫原性可生物降解，不會在體內(nèi)堆積可制成球狀(0.03~50m)，包容大小不同的生物活性分子可帶有不同的電荷具有不同的膜脂流動性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求第101頁，共119頁，2023年，2月20日，星期四㈡直接注射方法：注射，包埋溶液類型對基因表達(dá)有影響：重組DNA可貯存于5%~30%的蔗糖溶液中也可用生理鹽水或PBS第102頁，共119頁，2023年，