生物制片與顯微攝影技術(shù)課件zyl

學(xué)時(shí)學(xué)分：18學(xué)時(shí)，1學(xué)分課程性質(zhì)：專業(yè)必修課/任選課適用專業(yè)：生物技術(shù)專業(yè)課程內(nèi)容：講解植物顯微技術(shù)的原理和方法，并最終使學(xué)生掌握植物石蠟制片的方法及其各個(gè)環(huán)節(jié)的原理和技術(shù)要點(diǎn)。第一頁，共108頁。課程安排：

概述講授1次，3個(gè)學(xué)時(shí)，了解植物顯微制片技術(shù)的基本方法、程序和基本原理。其余時(shí)間分為5次實(shí)驗(yàn)，共計(jì)15學(xué)時(shí)，系統(tǒng)學(xué)習(xí)石蠟切片的制片技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)中熟悉、鞏固和擴(kuò)展生物制片的基本理論和技能。所以本課程是以實(shí)驗(yàn)為主的課程。第二頁，共108頁。講課內(nèi)容和學(xué)時(shí)安排：實(shí)驗(yàn)第次授課或?qū)嶒?yàn)題目主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容課時(shí)數(shù)理論概述生物顯微制片與攝影概述、石蠟切片制作程序、原理；31配制固定液等試劑、取材、固定清洗容器、配制固定液、各級(jí)度脫水劑、透明劑、取材、固定材料、脫酸；32脫水滲蠟觀摩、包埋脫水滲蠟觀摩、包埋、清洗載玻片和蓋玻片、配制粘片劑；33切片、貼片修整蠟塊、切片、貼片；34蘇木精染色、封片染色及相關(guān)程序、封片、貼標(biāo)簽35番紅-固綠染色、封片和顯微攝影脫水、對(duì)染、封片等相關(guān)程序、貼標(biāo)簽、顯微攝影3第三頁，共108頁。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)中每八至十人組成為一個(gè)實(shí)驗(yàn)小組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組從取材料開始，完成石蠟制片的全過程。如脫水、透明、浸蠟、包埋等環(huán)節(jié)是全天連續(xù)而不能間斷的過程，需要實(shí)驗(yàn)小組的幾個(gè)同學(xué)輪班完成。每個(gè)同學(xué)必需了解和掌握各個(gè)環(huán)節(jié)的工作技能。

實(shí)驗(yàn)要求：要求每個(gè)小組制作合格的石蠟制片不少于20片。每人獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)記錄，并且獨(dú)立完成制作切片不少于2片。第四頁，共108頁。成績(jī)?cè)u(píng)定辦法： 成績(jī)由五個(gè)部分構(gòu)成 出勤占20%。但實(shí)驗(yàn)課曠課缺勤一次，扣20分，請(qǐng)假一次扣10分，遲到、早退、未完成預(yù)定工作適當(dāng)扣分。 平時(shí)工作及實(shí)驗(yàn)的衛(wèi)生整理情況10%。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告占20% 實(shí)驗(yàn)記錄20% 制片數(shù)量和質(zhì)量占30%第五頁，共108頁。第一章緒論一、生物制片的目的

把想要觀察的材料制作成適合于在顯微鏡下觀察的薄片，以顯示其組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。二、生物制片的類型

顯微制片法一般包括切片法、整體封片法、涂片法和壓片法4大類。第六頁，共108頁。（一）臨時(shí)制片（二）永久制片第七頁，共108頁。（一）臨時(shí)制片

多數(shù)用于活體制片觀察（一種臨時(shí)制片）。 將生物個(gè)體或一部分置于載玻片上，加水和蓋玻片進(jìn)行觀察。包括：徒手切片、裝片、涂片、解離壓片等臨時(shí)制片。（在植物形態(tài)解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)等課程已經(jīng)講授，詳細(xì)過程不再贅述）

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、省時(shí)，能進(jìn)行活體觀察；缺點(diǎn)：常因組織過厚光線不易透過，活體材料多為無色，未染色觀察效果差，不易長(zhǎng)期保存。第八頁，共108頁。（二）永久制片

1.切片法

光學(xué)顯微鏡的切片厚度在2～25微米之間，一般動(dòng)植物材料的切片以厚10微米左右為合適。

用鋒利的刀片將材料切成薄片，便于在顯微鏡下觀察。為了能夠切出薄而且完整的切片，對(duì)幼嫩的材料（如，幼嫩的根尖、莖尖、葉片等）必須進(jìn)行包埋，對(duì)堅(jiān)硬的材料（如木材、竹材）必須進(jìn)行軟化而不用包埋。切片法在生物制片技術(shù)中最為重要。第九頁，共108頁。

切片法分為：（1）徒手切片法（不用包埋，徒手切片）（2）石蠟切片法（見后面詳述）（3）火棉膠切片法（4）冰凍切片法（5）木材切片法第十頁，共108頁。（3）火棉膠切片法

把生物材料經(jīng)火棉膠包埋后用滑動(dòng)切片機(jī)切片。適用于特別堅(jiān)硬的材料，或特別柔軟而體積大的材料（如完整的大腦）。由于過程復(fù)雜，已經(jīng)較少應(yīng)用。

火棉膠是一種硝化纖維素，易燃燒。火棉膠可以購買（火棉膠片或火棉膠乙醚或純酒精液），也可以自制。自制火棉膠：將照相的底片除去藥膜，溶于等量的乙醚或純酒精中，配制成不同濃度的火棉膠液。

制片原理：材料經(jīng)過固定、脫水，火棉膠液浸泡，火棉膠包埋，滑動(dòng)切片機(jī)切片，脫膠，染色，脫水，透明封片。

第十一頁，共108頁。（4）冰凍切片法

特別適用于水分多，柔軟，而且容易收縮的材料，如動(dòng)物組織，用滑動(dòng)切片機(jī)或旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，配上制冷裝置。第十二頁，共108頁。半自動(dòng)冷凍切片機(jī)（jx4352525）第十三頁，共108頁。（5）木材切片法

（滑走切片法、軟化切片法）該法適用于堅(jiān)硬的木材、竹材、骨質(zhì)的切片。

材料需要軟化，常用的軟化劑和軟化法有：甘油酒精法氫氟酸法醋酸纖維素法石炭酸軟化法冰醋酸：雙氧水（1：2）法

第十四頁，共108頁。2.非切片法（不用刀）（1）離析法（2）涂片法（3）壓片法（4）整體封固法（5）透明法第十五頁，共108頁。（1）離析法離析液種類很多，最常用的有：鉻酸-硝酸離析液硝酸-氯化鉀離析液鹽酸－草酸氨離析液氨水離析法氯化鉀（0.01M）或氯化鎂（0.01M）離析法氫氧化鉀（或氫氧化鈉）離析法第十六頁，共108頁。（2）涂片法

適用于單細(xì)胞生物或小型的群體藻類、組織疏松或易于分離的植物組織，如花粉囊中的花粉母細(xì)胞或花粉粒，根瘤組織、動(dòng)物的血液等。將生物組織的少許置于載玻片上，涂成薄層后再經(jīng)不同處理而作成制片，或再用另一片載玻片蓋在上面用力壓碎。第十七頁，共108頁。（3）壓片法

將生物組織的一部分置于載玻片上，并隔著蓋玻片將其壓散開來，而作成制片。

主要用于根尖、莖尖等解離材料的壓片，染色體觀察。與染色體涂抹法的區(qū)別是先把材料固定、軟化和染色，再進(jìn)行壓片。第十八頁，共108頁。（4）整體封固法

將細(xì)小或扁平的材料經(jīng)過染色等處理后，把整個(gè)材料用封固劑封起來作成制片。如苔蘚植物的葉子、絲狀體和膜狀體的藻類、扁形動(dòng)物渦蟲、昆蟲的鱗翅、薺菜的小花蕾等均可采用此法制片觀察。第十九頁，共108頁。（5）透明法

用化學(xué)藥劑處理，使組織變得透明而做成制片，例如將葉片處理，顯示葉脈。

第二十頁，共108頁。常用透明的方法乳酸－石炭酸透明法

乳酸－石炭酸液配制：石炭酸（結(jié)晶）10g，蒸餾水、乳酸、甘油各10毫升混合。 適用于小的材料的透明觀察：材料放于載玻片上，加一滴乳酸－石炭酸液，在酒精燈上來回移動(dòng)加熱，冷卻后材料變?yōu)橥该鳎僬w封片。

氫氧化鈉透明法

氫氧化鈉液配制：2－10％氫氧化鈉水溶液（通常為5％），或者2－10％氫氧化鈉水溶液＋50％酒精。溶液的量大于材料體積的30－50倍。材料放于氫氧化鈉溶液中24小時(shí)左右，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)被溶解，所以材料變的透明。第二十一頁，共108頁。第二章石蠟制片第一節(jié)石蠟切片的應(yīng)用范圍制片的方法雖然很多，但是其基本點(diǎn)就是要求盡量保持原來的結(jié)構(gòu)，切成適當(dāng)?shù)暮穸?，?yīng)用各種染色方法使內(nèi)部各種結(jié)構(gòu)清晰易見，使材料保持長(zhǎng)久，不變形、不腿色。

石蠟制片的優(yōu)點(diǎn)是一般的材料都適用、切片薄、能切成連續(xù)的蠟帶，可以觀察到細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的連續(xù)變化過程，這是其他方法所不及的。

缺點(diǎn)是制片過程復(fù)雜，不適合制作比較堅(jiān)硬的材料，如木材切片、竹材切片等等。第二十二頁，共108頁。第二節(jié)石蠟切片的步驟和原理石蠟切片包括：①選材（取材）②殺死、固定和保存③沖洗和脫水④透明⑤浸蠟和包埋⑥切片⑦貼片⑧染色⑨封片等9個(gè)大步驟。下面依次介紹。第二十三頁，共108頁。一、選材根據(jù)所要觀察的對(duì)象和目的進(jìn)行選材。通常選材時(shí)要考慮到以下幾方面因素：①種類、②部位、③年齡或發(fā)育階段、④今后是觀察橫切面還是縱切面。取材時(shí)一般的要求是新鮮、健康、正常、有代表性，一般大小不超過1厘米，在能滿足觀察的前提下越小越好，以便能使固定液迅速進(jìn)入組織、殺死細(xì)胞和便于切片。最好先通過徒手切片在顯微鏡下觀察，以便做到對(duì)目的部位心中有數(shù)，更準(zhǔn)確地取材。切割材料時(shí)，刀要鋒利，用力要均勻，避免組織被擠壓、撕裂等破裂，影響制片效果。第二十四頁，共108頁。二、殺死、固定和保存（一）殺死和固定

用物理的或化學(xué)的方法將生物材料迅速殺死、使蛋白質(zhì)變性和凝固，達(dá)到保持生活細(xì)胞的形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的目的，即保持生活時(shí)的自然狀態(tài)。固定要求是越快越好。

物理固定法常用冷凍處理或火焰烘烤。

化學(xué)固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定劑中。固定劑常常是含有幾種化合物的混合液，既有強(qiáng)烈凝固蛋白質(zhì)的化合物，也有非凝固性的化合物，它們對(duì)蛋白質(zhì)起交聯(lián)和穩(wěn)定作用，即所謂“鞣化作用”。

第二十五頁，共108頁。固定時(shí)要注意的事項(xiàng)：

（1）固定液的用量要達(dá)到材料體積的5-20倍，否則，材料中的水分稀釋固定劑的濃度，降低固定效果。

（2）固定時(shí)要對(duì)材料進(jìn)行真空抽氣。組織、細(xì)胞中都有空氣，會(huì)阻止固定劑滲透到組織中，使固定不全面和不徹底，影響后續(xù)的浸蠟、切片等等。抽氣最好用抽氣泵抽氣，簡(jiǎn)易的可以用注射器針筒抽氣。第二十六頁，共108頁。（二）保存

材料經(jīng)過固定后，需要保存下來以備利用，這一過程中，要求材料的結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生變化?？梢允挂话愕牟牧媳４孑^長(zhǎng)的時(shí)間而不至于變壞。保存時(shí)，通常還要求在冰箱中存放。

有些殺死劑和固定劑本身就是良好的保存劑，有些則不然。

第二十七頁，共108頁。塑料藥瓶第二十八頁，共108頁。（三）好的固定劑的特點(diǎn)1.滲透力強(qiáng)迅速殺死原生質(zhì)，并顯示出其原來的細(xì)微結(jié)構(gòu)；2.增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物的折光程度，使各部結(jié)構(gòu)更為清晰，有利于顯微鏡觀察；3.使組織適當(dāng)?shù)刈冇玻⒕哂幸欢ǖ膱?jiān)韌性，便于切片。但又不能過于堅(jiān)硬或變?yōu)樗纱?，反而不利于切片?.促進(jìn)生物組織對(duì)某些染色劑的媒染作用，能使組織增加染色能力；5.使組織或細(xì)胞不發(fā)生收縮和膨脹；6.有良好的保存作用，使材料固定后能經(jīng)久不壞。第二十九頁，共108頁。

（四）主要的固定劑及其性質(zhì)第三十頁，共108頁。1.純酒精優(yōu)點(diǎn)：滲透力強(qiáng)，有脫水作用缺點(diǎn)：原生質(zhì)收縮注意要點(diǎn)：?jiǎn)为?dú)用時(shí)，時(shí)間要短，幾分鐘到1小時(shí)足夠。酒精是還原劑，易被氧化成乙醛和乙酸，不宜與鉻酸、重鉻酸鉀或鋨酸等配合。能與甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生不溶性沉淀，使核酸發(fā)生可溶性沉淀，還可以溶解脂類物質(zhì)，不適宜用于這一類材料的固定第三十一頁，共108頁。2.95%酒精優(yōu)點(diǎn)：材料固定后無需沖洗就可以脫水，使用簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：原生質(zhì)收縮，但仍然能保持細(xì)胞壁的形狀注意要點(diǎn)：?jiǎn)为?dú)用時(shí)，時(shí)間十幾分鐘到1-2小時(shí)足夠。固定時(shí)間長(zhǎng)，材料變脆、易折斷，難以切片；適宜制作無需保存細(xì)胞內(nèi)含物的切片。第三十二頁，共108頁。3.甲醛(Formalin),HCOH福爾馬林

優(yōu)點(diǎn)：市面出售為飽和液，濃度為40%，又稱福爾馬林，是很好的硬化劑，缺點(diǎn)：材料易收縮。滲透力慢。與酒精混合，可以阻止材料過于堅(jiān)硬注意要點(diǎn)：?jiǎn)为?dú)用時(shí)，濃度一般為5-10%。是強(qiáng)還原劑，易氧化為蟻酸，故不能與洛酸或鋨酸等配合。甲醛儲(chǔ)存過久會(huì)變成蟻醛酸，可加入5%的吡啶中和。第三十三頁，共108頁。9.冰醋酸(glacialaceticacid)H3COOH優(yōu)點(diǎn)：滲透力強(qiáng)而快，能溶解脂肪，可保存蛋白質(zhì)不變質(zhì)，是染色體很好的保存劑。缺點(diǎn)：組織發(fā)脹，可阻止酒精、甲醛等引起的收縮注意要點(diǎn)：通常以1-5%的濃度作固定劑第三十四頁，共108頁。4.鉻酸（cronicacid）H2CrO4優(yōu)點(diǎn)：固定蛋白質(zhì)、核蛋白、核酸等產(chǎn)生良好的不溶性沉淀。它對(duì)脂肪和擬脂類沒有作用。生物制片中使用廣泛，尤其在細(xì)胞學(xué)制片中不可缺少，是許多固定劑的基本成分。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)是組織易收縮，滲透力弱，而且組織易過度硬化。一般以0.5-1%水溶液用，用量要多，固定后用水徹底沖洗干凈。

第三十五頁，共108頁。5.苦味酸（三硝基苯酚）（picricacid）C6H2(NO2)3OH優(yōu)點(diǎn)：常用其飽和水溶液(溶解度0.9--1.4%)固定，使蛋白質(zhì)、核蛋白、核酸沉淀，對(duì)于胚囊自由核時(shí)期的固定效果很好，還可以阻止過度硬化和增進(jìn)染色效果缺點(diǎn)：滲透力強(qiáng)，但組織收縮強(qiáng)，注意要點(diǎn)：很少單獨(dú)使用；苦味酸是易爆品，如果單純備以制片，保存苦味酸時(shí)，要適當(dāng)加入水分，密封，防曬、防震，否則有爆炸的危險(xiǎn)。第三十六頁，共108頁。6.鋨酸OsO4（osmicacid）

優(yōu)點(diǎn)：能良好固定細(xì)胞的細(xì)微構(gòu)造，是脂肪類的唯一固定劑。是細(xì)胞學(xué)研究的最好固定劑，在電鏡的超薄切片中作為主要的固定劑。材料經(jīng)此固定后，能防止用酒精脫水時(shí)產(chǎn)生沉淀。缺點(diǎn)：是目前最昂貴最好的固定劑。滲透力很弱，因而往往材料外部已經(jīng)固定過度，而內(nèi)部還未完全固定，所以材料越小越好。

第三十七頁，共108頁。7.重鉻酸鉀K2Cr7O7(potassiumdichromate)優(yōu)點(diǎn)：強(qiáng)烈硬化劑，但是滲透力很弱，所以材料越小越好。缺點(diǎn)：強(qiáng)烈的氧化劑，不能與甲醛、酒精混合。很少單獨(dú)使用。注意要點(diǎn)：因配合物不同，具有不同的效果。與酸性液體混合時(shí)，在PH4.2以下，可以固定染色體，但不能固定線立體。PH5.2以上，可以溶解染色體，但是細(xì)胞質(zhì)則保持得均勻一致，尤其固定線立體效果好。配置成1-3%水溶液使用，其飽和水溶液濃度約9%。第三十八頁，共108頁。8.氯化汞HgCl2（升汞）(mercuricchloride)優(yōu)點(diǎn)：作用快，滲透力強(qiáng)，固定蛋白質(zhì)，不足是細(xì)胞易收縮。缺點(diǎn)：升汞留于細(xì)胞中會(huì)形成結(jié)晶，所以用升汞固定的材料一定要及時(shí)切片或處理。注意要點(diǎn)：用其固定的材料不能久留，要及時(shí)包埋，以免材料經(jīng)久會(huì)變壞。要清洗干凈。劇毒。第三十九頁，共108頁。（五）混合固定劑

實(shí)際使用中幾乎都是用混合固定劑，使單一固定劑的缺點(diǎn)得到彌補(bǔ)，如能使細(xì)胞收縮的試劑要與能使細(xì)胞膨脹的試劑配合使用等等。強(qiáng)氧化劑與強(qiáng)還原劑也不能同時(shí)配制在一起，如果需要混合使用，也要分開配制，用時(shí)再混合。１.產(chǎn)生酸性固定相的固定液 這類固定劑產(chǎn)生的固定相完全呈酸性反應(yīng)，對(duì)染色質(zhì)和核仁具有良好的固定，但是細(xì)胞內(nèi)含物被溶解。植物制片中應(yīng)用的固定劑大多數(shù)屬于這類固定劑。第四十頁，共108頁。（1）酒精-甲醛固定劑

70%酒精100ml+甲醛10-20ml

用于固定一般生物組織，不發(fā)生收縮，效果很好。尤其用于在柱頭上萌發(fā)的花粉管的固定。染色質(zhì)和核仁固定良好，內(nèi)含物被溶解。固定的時(shí)間通常為24小時(shí)，也可以作保存劑。甲醛的用量可視材料而定。第四十一頁，共108頁。（2）F.A.A.固定劑（酒精-甲醛Formalin-冰醋酸glacialaceticacid固定劑）

配方：50%-70%酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛（40%）5ml

使用方便、效果較好、應(yīng)用也最廣?？梢怨潭ㄒ话阒参锊牧虾屠ハx、甲殼類動(dòng)物。又是良好的保存液。固定時(shí)間幾個(gè)小時(shí)以上。不適宜細(xì)胞學(xué)和藻類學(xué)用途的固定，因?yàn)榫凭梢匀芙庵惣笆乖|(zhì)收縮。

保存時(shí)，在上述的配方中按體積的5%加入甘油（體積比）能防止液體蒸發(fā)和材料變硬，保存效果更佳。經(jīng)過FAA固定的材料，用50-70%的酒精換洗2次就可以進(jìn)行脫水。第四十二頁，共108頁。（3）酒精-醋酸固定液

(卡諾（carnoy）固定液)：甲液：純酒精15ml+冰醋酸5ml現(xiàn)用現(xiàn)配，不能久放乙液：純酒精30ml+冰醋酸5ml+氯仿15ml現(xiàn)用現(xiàn)配，不能久放可以甲液、乙液等量混合使用，但是使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)混合。滲透力強(qiáng)，只需要20分鐘至3小時(shí)，時(shí)間太久則材料受到破壞，材料膨脹、發(fā)粘。固定畢，需要用純酒精洗滌2-3次，直至材料不含冰醋酸及氯仿的氣味為止。第四十三頁，共108頁。2.產(chǎn)生堿性固定相的固定液

這類固定液產(chǎn)生的固定相完全為堿性反應(yīng)，所有的染色質(zhì)均可以溶解，該類固定液適合線粒體和液泡等的固定。第四十四頁，共108頁。產(chǎn)生堿性固定相的固定液主要有以下兩種：（1）齊－歐氏液（Zirkle-Erliki） 重鉻酸氨1.25克+硫酸銅1克+蒸餾水200毫升（2）齊氏還原鉻酸液

硫酸鉻5克+氧化銅稍過量（即飽和并稍過量）+甲醛10－50毫升+蒸餾水50－90毫升（最后使溶液總量為100毫升）第四十五頁，共108頁。三、沖洗與脫水（一）沖洗的意義

材料經(jīng)固定后，在進(jìn)行下一步或?qū)⒉牧媳４嫫饋砬?，一般都要把材料沖洗干凈，作用是讓沖洗液滲透到材料中，把固定液徹底替換出來。

常用的沖洗液是蒸餾水或一定濃度的酒精。一般水溶性的固定液用水來沖洗，酒精溶液的固定液用同濃度的酒精來沖洗。第四十六頁，共108頁。（二）沖洗的方法

1.一般材料在試管或試劑瓶中更換數(shù)次（傾倒或用吸管吸出），每次1-2小時(shí)即可。

2.某些難洗凈的材料用流水沖洗一定時(shí)間。

第四十七頁，共108頁。指管和膠塞第四十八頁，共108頁。（三）脫水的作用

脫水就是把材料浸泡到能夠與水分混溶的藥劑中，使材料中的水分逐步（逐級(jí)）被吸出，最后全部被代替干凈，有兩個(gè)作用： 1.使材料變硬，形狀更加穩(wěn)定。 2.除凈材料中的水分，才能使包埋劑和封固劑滲透到組織中。因?yàn)橥ǔ５陌駝┖头夤虅┒疾荒芘c水混合，把水除凈才能進(jìn)行包埋和封固。 務(wù)必注意：脫水劑的濃度要分為多級(jí)從低到高逐級(jí)進(jìn)行。第四十九頁，共108頁。（四）常用的脫水劑脫水劑應(yīng)該具備2個(gè)特點(diǎn)： 第一，必須是親水性的，能與水成任何比例的混溶； 第二，必須能與其他有機(jī)溶劑（透明劑）互相混合和取代。常用的脫水劑有以下幾種：

酒精、氧化二乙烯、正丁醇、叔丁醇、丙酮、甘油、第五十頁，共108頁。酒精：是最廣泛的脫水劑，主要是價(jià)格較低，方法易掌握。不足之處是易引起組織收縮或硬化，不利于切片（尤其是純酒精脫水，時(shí)間要短）。氧化二乙烯：可以和水、酒精及油類混合，優(yōu)點(diǎn)是具有脫水和透明的作用，也不會(huì)使組織硬化和收縮，經(jīng)過30%-70%-90%-100%各級(jí)，就可以進(jìn)行浸蠟。缺點(diǎn)是它的比重比較溶化的石蠟重，所以在包埋前要?jiǎng)?wù)必除掉之，一般是用一次二甲苯或氯仿，然后再浸蠟，就可以避免上述的缺點(diǎn)。另外，揮發(fā)性大，易燃，多吸入它的氣體對(duì)人體有害。第五十一頁，共108頁。正丁醇：通常與酒精合成一定的比例使用，到最后才經(jīng)過100%的正丁醇，優(yōu)點(diǎn)是具有脫水和透明的作用，用它脫水后不必經(jīng)過透明就可以浸蠟，使手續(xù)簡(jiǎn)化。叔丁醇：可與水、酒精、二甲苯等混合。可單獨(dú)或與酒精混合使用。優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)使組織收縮和變硬，也不必再透明，而且比溶化的石蠟輕，所以在包埋時(shí)很容易被從組織中除去。此法可以簡(jiǎn)化脫水、透明等過程，已經(jīng)逐漸替代了酒精。但是價(jià)格比酒精貴3倍。第五十二頁，共108頁。丙酮：可以代替酒精，脫水作用比一般的要快，但是不能溶解石蠟，所以仍需經(jīng)過二甲苯或其他透明劑，才能進(jìn)行浸蠟和包埋。甘油：較少用。第五十三頁，共108頁。四、透明

材料脫水之后，一般要經(jīng)過一種既能與脫水劑又能與包埋劑（石蠟、火棉膠）相混合的溶劑來處理，以便于包埋劑滲入到組織中。由于這種溶劑能使材料透明，因此這個(gè)過程稱為“透明”。

在制片中除了應(yīng)用一些既能脫水又能透明的脫水劑（氧化二乙烯、正丁醇、叔丁醇等）外，一般用酒精脫水的材料，都要經(jīng)過透明。常用的透明劑有下列幾種：

二甲苯、氯仿、甲苯、苯、丁香油第五十四頁，共108頁。1．二甲苯：是應(yīng)用最廣的透明劑，作用迅速，能溶解石蠟、加拿大樹膠。缺點(diǎn)是易使材料收縮變脆。使用時(shí)，材料必須徹底脫盡水分，否則發(fā)生乳狀渾濁。 為了避免材料收縮，采取逐步從純酒精中過渡到二甲苯中，如 純酒精→2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→純二甲苯（最后的時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則材料收縮和變脆）

第五十五頁，共108頁。2．氯仿：火棉膠的制片都采用氯仿作透明劑，也可應(yīng)用于石蠟法中。揮發(fā)性比二甲苯快，滲透力較弱，使材料的收縮性也小。氯仿能破壞染色，所以不能對(duì)已經(jīng)染色的切片進(jìn)行透明（不能用于封片前的透明）。3．甲苯：性能與二甲苯相同，價(jià)格較便宜，可作二甲苯的代用品。4．苯：性能與二甲苯相似，可作二甲苯的代用品。第五十六頁，共108頁。5．丁香油（cloveoil）：切片染色后，在封固前最好的透明劑。固綠、桔紅G等可以溶解于丁香油中成飽和劑，待染色到最后一步時(shí)，可以作為染色、分色、透明的綜合溶劑，效果較好。但是經(jīng)過丁香油透明后的制片，還需要在二甲苯中處理，將組織中的殘油除凈，否則制片混暗不清。還有，丁香油揮發(fā)很慢，如果不經(jīng)過二甲苯處理，制片封片后不易干固。注意：丁香油價(jià)格昂貴，要節(jié)約使用。第五十七頁，共108頁。五、浸透（透蠟）和包埋（一）石蠟浸透法

材料完全透明以后，就要浸蠟。浸蠟的目的在于用融化的石蠟（或火棉膠）代替材料中的透明劑。最重要的是使融化的石蠟完全浸入到細(xì)胞的每個(gè)部分，并使石蠟緊密地貼在細(xì)胞壁的內(nèi)外，成為不可分離的狀態(tài)，這樣切片時(shí)材料才不會(huì)切壞。

注意：這是最重要的一步，如果透蠟不徹底，材料中有空洞，切片時(shí)會(huì)使材料切壞。浸蠟一般要從低溫至高溫，從低濃度到高濃度，使石蠟慢慢滲入組織內(nèi)，將透明劑替代出來。操之過急，則石蠟浸入不徹底，影響切片。第五十八頁，共108頁。

浸蠟的步驟： 低熔點(diǎn)碎石蠟少許溶化在有材料的透明劑中（36-40度恒溫箱中微加熱），溶化后不斷加入碎石蠟直至達(dá)到1/2透明劑:1/2石蠟（體積比）為止（每次加蠟后都將透明劑瓶蓋上，以免透明劑過渡蒸發(fā)）。幾小時(shí)后，移入58-60度的溫箱中，打開瓶塞讓透明劑蒸發(fā)（幾小時(shí)）。之后，將材料移入裝有溶化石蠟的小杯中（換容器的目的是便于下一步操作）換上高熔點(diǎn)蠟液（仍然在58-60度溫箱中），數(shù)小時(shí)后換純蠟一次，至數(shù)小時(shí)后材料完全被石蠟浸透（通常換三次），透明劑也已被石蠟完全替代。第五十九頁，共108頁。數(shù)顯組織自動(dòng)脫水機(jī)第六十頁，共108頁。第六十一頁，共108頁。第六十二頁，共108頁。恒溫箱第六十三頁，共108頁。（二）包埋

包埋就是將完成滲透蠟的材料移至包埋劑（石蠟）中，以便切片。第六十四頁，共108頁。第六十五頁，共108頁。生物組織包埋機(jī)第六十六頁，共108頁。六、切片（一）修蠟塊和粘蠟塊

1．修蠟塊 用鋒利的單面刀片將包有材料的蠟塊小心地切削成規(guī)則的形狀，最好為梯形或方塊形， 要求：蠟塊不能有裂縫或裂紋，蠟塊中的材料要在蠟塊的中央，絕對(duì)不能使材料直接露出來。

第六十七頁，共108頁。第六十八頁，共108頁。第六十九頁，共108頁。第七十頁，共108頁。2125輪轉(zhuǎn)切片機(jī)第七十一頁，共108頁。萊卡2235切片機(jī)第七十二頁，共108頁。2．粘蠟塊（焊蠟塊） 準(zhǔn)備好若干載蠟器（臺(tái)木約1×2×2cm3的小木塊，事先用廢蠟浸泡一周左右），廢棄的手術(shù)刀或或單面刀片，用果刀亦可，點(diǎn)燃酒精燈； 先將碎石蠟熔化在臺(tái)木的一端； 在酒精燈上加熱的小鐵片或廢棄的手術(shù)刀的幫助下，將修理好的蠟塊的一端牢固地粘連在小木塊上。要求：蠟塊要端正地粘連在小木塊上，粘連越牢固越好。第七十三頁，共108頁。（二）切片將蠟塊切成很薄的片石蠟切片用切片機(jī)切可以形成蠟帶。

第七十四頁，共108頁。七、展片和粘片（貼片）

這是同時(shí)進(jìn)行和完成的兩個(gè)步驟。切片經(jīng)過鏡檢可用后，就要用粘貼劑將具有目的材料的蠟片粘貼在載玻片上，并要使材料在后續(xù)的溶蠟、染色、脫水等過程中都不會(huì)從載玻片上脫落下來。

第七十五頁，共108頁。粘片和展片的方法常用的有兩種：⒈烤片貼片法⒉水浴（用水浴鍋或攤片機(jī)）展片法第七十六頁，共108頁。烘片機(jī)和烤片臺(tái)生物組織攤烤片機(jī)第七十七頁，共108頁。晾片板第七十八頁，共108頁。晾片板第七十九頁，共108頁。切片盒第八十頁，共108頁。常用的粘貼劑有以下幾種：①明膠粘貼劑②火棉膠粘貼劑③蛋白粘貼劑第八十一頁，共108頁。①明膠粘貼劑（Hauptaffixative，郝伯特粘貼劑）

使用最為廣泛 配方：明膠（粉狀）1g+蒸餾水100ml（36℃）（明膠溶化后）+石炭酸（結(jié)晶）2g+甘油15ml（溶化），最后用濾紙過濾。

第八十二頁，共108頁。 ②火棉膠粘貼劑

火棉膠1-2g溶解在純酒精和乙醚各半的混合液中，即為火棉膠粘貼劑。 較厚的材料(如木材切片、種子切片等等)，如果只用普通的粘貼劑貼片，往往容易脫落。可以在上述操作的基礎(chǔ)上（干后），再用1-2%的火棉膠粘貼劑滴在材料上，并使之干燥。染色時(shí)，可用石炭酸：二甲苯（1：4）除去石蠟，再置入95%的酒精，順次進(jìn)行染色。第八十三頁，共108頁。③蛋白粘貼劑（梅耶爾氏粘片劑）

新鮮雞蛋青25ml+甘油25ml+石炭酸0.5g（為防腐劑）配制：雞蛋打孔，倒出蛋青，加入甘油和防腐劑，用力搖動(dòng)，產(chǎn)生很多泡沫，靜止片刻，使泡沫上升到液面，倒去泡沫或用紗布過濾，即可。 此劑在動(dòng)物上應(yīng)用更廣，在植物上效果也很好。兩點(diǎn)注意：其一，粘性比明膠弱；其二，配好后1-2個(gè)月內(nèi)易失效，所以一般是每次實(shí)驗(yàn)臨時(shí)配。

第八十四頁，共108頁。八、染色

染色是為了使不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，更好地弄清楚它們的結(jié)構(gòu)。九、脫水十、透明十一、封藏十二、貼標(biāo)簽染色之前首先要進(jìn)行脫蠟、復(fù)水，染色之后還需有分色、沖洗等相關(guān)步驟，染色之后再經(jīng)脫水、透明，最后封藏及完成制片。第八十五頁，共108頁。下面以番紅--固綠對(duì)染法和海登漢氏蘇木精染色法的全部流程來說明以上幾個(gè)過程：第八十六頁，共108頁。臥式染色缸第八十七頁，共108頁。第八十八頁，共108頁。第八十九頁，共108頁。染色架第九十頁，共108頁。染色架第九十一頁，共108頁。二甲苯Ⅰ10分種以上二甲苯Ⅱ10分種以上1/3二甲苯+2/3無水乙醇5--10分鐘2/3二甲苯+1/3無水乙醇5--10分鐘無水乙醇Ⅰ5分種無水乙醇Ⅱ5分種95%乙醇5--10分鐘85%乙醇5--10分鐘70%乙醇5-10分鐘50%乙醇5--1分鐘30%乙醇5--10分鐘海氏蘇木精染色約15--30分鐘自來水流水沖洗或浸泡沖洗幾遍約15分鐘左右3%硫酸鐵銨水液媒染3分鐘左右媒染和染色脫蠟復(fù)水海登漢氏蘇木精染色流程第九十二頁，共108頁。自來水流水沖洗或浸泡沖洗幾遍約10分鐘飽和苦味酸液分色5分鐘左右自來水流水沖洗幾遍或少加1-幾滴氨水浸泡約10分鐘，鏡檢細(xì)胞質(zhì)呈天藍(lán)色即可30%乙醇5--10分鐘50%乙醇5--1分鐘70%乙醇5-10分鐘85%乙醇5--10分鐘95%乙醇5--10分鐘無水乙醇Ⅱ5分種無水乙醇Ⅰ5分種1/3二甲苯+2/3無水乙醇5--10分鐘2/3二甲苯+1/3無水乙醇5--10分鐘二甲苯Ⅰ10分種以上二甲苯Ⅱ10分種以上封藏沖洗、分色脫水透明第九十三頁，共108頁。二甲苯Ⅲ5分種以上二甲苯Ⅰ10分種以上二甲苯Ⅱ10分種以上1/3二甲苯+2/3無水乙醇5--10分鐘2/3二甲苯+1/3無水乙醇5--10分鐘無水乙醇Ⅰ3--5分種無水乙醇Ⅱ3--5分種95%乙醇3--10分鐘85%乙醇3--10分鐘70%乙醇3-10分鐘50%乙醇3-10分鐘30%乙醇5--10分鐘1g固綠+95%酒精100毫升對(duì)染0.5--1分鐘1%番紅50%乙醇2--24小時(shí)1%番紅水液2--24小時(shí)脫蠟染色脫水和對(duì)染（返回）透明（返回）封藏番紅-固綠對(duì)染流程下行流程返回流程復(fù)水第九十四頁，共108頁。全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)LS-3050B第九十五頁，共108頁。（三）染色劑的種類

1．根據(jù)化學(xué)性質(zhì)分：依據(jù)染料的主要有色部分是正離子或負(fù)離子，或正負(fù)離子都有來區(qū)分。染料的酸堿類型與染料溶液的酸堿反應(yīng)無直接關(guān)系

（１）堿性染料：主要有色部分是正離子，具有一種有色的有機(jī)鹽基，能與無色的醋酸鹽、氯化鹽、硫酸根等結(jié)合，一般溶于水或酒精，如番紅、蘇木精。

（２）酸性染料：主要有色部分是負(fù)離子，具有鈉或鉀的金屬基，能與一種有色的有機(jī)酸根結(jié)合，溶于水和酒精，如，固綠、曙紅。

（３）中性染料：正、負(fù)離子都有色，由堿性染料和酸性染料結(jié)合而成，也稱復(fù)合染料。其正離子和負(fù)離子都有一個(gè)發(fā)色團(tuán)。溶于水和酒精，如，吉姆薩。第九十六頁，共108頁。2．根據(jù)對(duì)生物組織著色情況分：

（1）組織染料：能夠使植物組織染色

（2）細(xì)胞染料：①細(xì)胞質(zhì)染料：能使細(xì)胞質(zhì)染色②細(xì)胞核染料：能使細(xì)胞核染色第九十七頁，共108頁。 3．根據(jù)染色劑的來源分

（1）天然染料從動(dòng)植物體中提取、純化而成。

（2）合成染料（煤焦燃料）

第九十八頁，共108頁。1）蘇木精（hematoxylin）：從蘇木中提取。蘇木是云實(shí)科一種植物，原產(chǎn)墨西哥。

蘇木精結(jié)構(gòu)式C16H14O6，配制好后最終成為有色可用的氧化蘇木精時(shí)為C16H12O6。

優(yōu)點(diǎn)有對(duì)細(xì)胞核染色，“多色性”，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異，在一個(gè)切片上只要經(jīng)過適宜的分色作用，就可以得到