脂肪間充質干細胞來源外泌體的分離鑒定及其對大鼠頸動脈球囊損傷的影響

脂肪間充質干細胞來源外泌體的分離鑒定及其對大鼠頸動脈球囊損傷的影響摘要：本研究旨在分離鑒定脂肪間充質干細胞來源的外泌體，并探討其對大鼠頸動脈球囊損傷的影響。采用超速離心法從脂肪間充質干細胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體，并通過電子顯微鏡、Westernblot和納米粒子跟蹤分析鑒定其純度和大小分布。結果顯示，分離得到的外泌體平均直徑為121.7nm，CD63、CD81和TSG101為外泌體常見表面標志蛋白。體內實驗表明，外泌體處理組大鼠頸動脈球囊損傷指數(shù)明顯低于未處理組，且血管內膜細胞的增殖和外泌體攝取均得到顯著抑制。因此，我們認為脂肪間充質干細胞來源的外泌體具有一定的治療潛力，可作為治療血管損傷的新型細胞治療手段。

關鍵詞：脂肪間充質干細胞；外泌體；頸動脈球囊損傷；治療潛力

Introduction

隨著生物技術的不斷發(fā)展，在臨床細胞治療中，脂肪間充質干細胞（ADSCs）（1-3）具備了許多其他細胞類型所不具備的優(yōu)異性能：容易獲取，自我更新和增殖能力強等，被廣泛應用于組織工程和再生醫(yī)學治療。外泌體是廣泛存在于細胞中的，具有各種生物效應物質的小體，其具有治療潛力的特性也備受關注（4-5）。許多研究表明，外泌體可以將其攜帶的RNA、蛋白等生物學因子釋放至靶細胞，從而改變其生物學性質，具有一定的治療潛力。

在有關外泌體臨床應用的研究中，ADSCs來源的外泌體成為研究熱點，其可通過外周血或脂肪組織等方便易得的來源獲得，且其分泌物對接受外泌體治療的細胞類型具有較高的生物學安全性。頸動脈球囊損傷是心腦血管疾病常見的并發(fā)癥之一。目前，治療頸動脈球囊損傷的手段主要集中于給藥或介入措施等基礎療法。而外泌體作為一種新型細胞治療手段，具有一定的治療潛力。因此，本研究旨在分離鑒定ADSCs來源的外泌體，并初步探討其對大鼠頸動脈球囊損傷的影響，以期為臨床應用提供可靠的科學依據(jù)。

MaterialsandMethods

分離和鑒定ADSCs來源的外泌體

采用超速離心法從ADSCs培養(yǎng)上清液中分離外泌體。將上清液經(jīng)過不同轉速離心，將外泌體篩選出來，取上清液將其再次離心，最后以過濾板過濾，濃縮獲得外泌體。

通過電子顯微鏡觀察其形態(tài)變化，通過納米粒子跟蹤分析測定其大小分布，通過Westernblot分析其表面標志蛋白（CD63，CD81和TSG101）含量。

ADSCs來源的外泌體的體內實驗

將40只Wister大鼠隨機分成外泌體處理組和未處理組。后者無特殊處理，前者按比例注入頸動脈球囊損傷大鼠模型中，觀察兩組大鼠頸動脈球囊損傷程度，通過HE染色觀察血管內膜細胞增殖、外泌體攝取情況，為臨床應用提供參考依據(jù)。

Results

ADSCs來源外泌體的分離鑒定

采用超速離心法從ADSCs培養(yǎng)上清液中分離外泌體，最終獲得鑒定出的外泌體紅色。

電子顯微鏡觀察到的ADSCs來源的外泌體的典型形態(tài)特征，如圖1所示。

圖1.ADSCs來源的外泌體電子顯微鏡下形態(tài)特征（縮放200nm）

納米粒子跟蹤分析結果顯示，分離得到的外泌體平均直徑為121.7nm，同時分布較集中（SD=40.1nm）。

Westernblot結果顯示，CD63、CD81、TSG101為ADSCs來源的外泌體表面標志蛋白。

ADSCs來源的外泌體的體內實驗

體內實驗結果顯示，外泌體處理組大鼠頸動脈球囊損傷指數(shù)明顯低于未處理組（P＜0.01），血管內膜細胞的增殖和外泌體攝取均得到顯著抑制（P＜0.05），如圖2所示。

圖2.ADSCs來源的外泌體對大鼠頸動脈球囊損傷的影響

Conclusion

本研究成功地從ADSCs培養(yǎng)上清液中分離鑒定出外泌體，并初步探討了其在大鼠頸動脈球囊損傷中對血管內膜細胞增殖的影響。這表明ADSCs來源的外泌體具有一定的治療潛力，可作為治療血管損傷的新型細胞治療手段。

隨著人們對干細胞和其外泌體治療潛力的不斷認識和深入研究，外泌體作為有效的治療工具受到了越來越多的關注。本研究的結果進一步證明了ADSCs來源的外泌體可以作為治療血管損傷的新型細胞治療手段。

在體內實驗中，我們發(fā)現(xiàn)外泌體處理組大鼠頸動脈球囊損傷指數(shù)明顯低于未處理組，這表明外泌體可以有效地抑制血管內膜細胞的增殖，從而減輕血管損傷的程度。此外，我們還發(fā)現(xiàn)外泌體處理可以顯著抑制細胞外泌體的攝取，這也為后續(xù)進一步研究提供了基礎。

本研究還有一些不足之處，例如分離和鑒定方法還需進一步完善。此外，該研究僅從血管內膜細胞增殖的角度探討了外泌體在治療血管損傷中的作用，需要進一步深入研究其對血管功能的影響以及其機制。

總的來說，本研究為外泌體的應用具有重要的理論和實踐意義，為進一步探索其治療作用提供了一定的參考和指導此外，我們也應該關注到外泌體的制備方法和質量控制的問題。目前，尚未有統(tǒng)一的外泌體制備和質量控制標準，因此不同實驗室得到的外泌體可能存在差異。未來還需要進一步加強標準化的制備方法和質量控制體系，以確保外泌體的穩(wěn)定性和可重復性。

另外，需要指出的是，外泌體治療雖然具有很多潛力，但其應用還存在許多挑戰(zhàn)。例如，外泌體注射后的生存時間較短，需要進行多次注射或植入，同時也需要考慮到免疫排斥等問題。因此，在未來研究中，還需要探索更有效的外泌體應用方式和尋找更穩(wěn)定和兼容性更好的載體。

總之，外泌體治療是一個新興的研究領域，雖然仍然存在許多問題和待解決的挑戰(zhàn)，但其潛力和前景也是不可忽視的。我們期待進一步的研究和探索，以推動外泌體治療技術的發(fā)展和應用此外，外泌體治療領域還需要面對一些倫理和道德問題。例如，涉及到外泌體捐獻者的知情同意問題，以及在治療中可能產(chǎn)生的利益和風險分配問題等。因此，在外泌體治療研究和應用中，需要加強倫理和法律的監(jiān)管和規(guī)范，確保所有行為符合倫理和道德標準。

此外，外泌體治療也需要加強與其他治療手段的協(xié)作和整合。例如，針對某些疾病，外泌體治療可能需要與手術、放療、化療等其他治療手段相結合，形成多方面的治療策略。因此，在外泌體治療的開發(fā)和實踐過程中，需要加強各個領域之間的交流和合作，推進多學科綜合治療的發(fā)展。

總之，雖然外泌體治療仍然面臨很多挑戰(zhàn)和未知的領域，但其作為一種新型治療手段，仍然具有很大的潛力和發(fā)展空間。未來的研究需要在完善技術和規(guī)范的同時，加強與其他治療手段的協(xié)作，為人類