0.05%環(huán)孢素滴眼液穩(wěn)定性的長期試驗考察藥學(xué)專業(yè)

#0.05%環(huán)孢素滴眼液穩(wěn)定性的長期試驗考察1.前言環(huán)孢素(Cyclosporine,CS)是一種真菌源性、由11個氨基酸組成的親脂性環(huán)狀多肽類物質(zhì)，也是一種高效免疫抑制劑。它廣泛地應(yīng)用于器官移植和多種自身免疫性疾病的治療中［1］，也是國際上認可的可以治療干眼癥的處方藥［2］。其藥理作用主要通過選擇性、可逆性地抑制T淋巴細胞而實現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，作用于T細胞活化過程中信號，抑制神經(jīng)鈣蛋白，進而抑制T細胞增長與分化⑶，最終達到免疫抑制效果。在臨床上多用于治療器官移植后的免疫排斥反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［4］等自身免疫疾病，并且可提高存活率。環(huán)孢素用于眼表疾病也具有顯著的療效。其在眼科的應(yīng)用分為全身用藥和局部用藥兩種方式。然而全身用藥受到血-眼屏障等因素不易進入眼內(nèi)，并且會帶來嚴重的不良反應(yīng)［5］，因此多為眼局部用藥。角膜移植排斥反應(yīng)是由供體角膜的特殊抗原引起的一種炎性反應(yīng)。環(huán)孢素作為一種強效免疫抑制劑，可有效抑制角膜移植后的免疫排斥反應(yīng)［6］，在臨床的治療方面仍以糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素為主，但是長時間應(yīng)用激素會產(chǎn)生多種不良反應(yīng)。環(huán)孢素抑制T細胞由G0期向G1期轉(zhuǎn)變，從而抑制T淋巴細胞的抗原呈遞并抑制白介素2和Y-干擾素的產(chǎn)生，減輕術(shù)后的排斥反應(yīng)⑺。蠶蝕性角膜潰瘍又名Mooren's潰瘍，是一種慢性、進行性、疼痛性角膜潰瘍，初發(fā)于角膜周邊部位，沿角膜周邊部延伸，并向角膜中央匍行發(fā)展，最終累及全角膜。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用激素和環(huán)孢素滴眼液及環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑藥物治療。該術(shù)后藥物維持治療研究結(jié)果［8］證明局部環(huán)孢素滴眼液單獨或聯(lián)合板層角膜移植術(shù)可以有效治療難治性蠶蝕性角膜潰瘍。腺病毒感染引起的流行性角膜結(jié)膜炎(Epidemickeratitisconjunctivitis，EKC)是一種世界性廣泛流行的眼部傳染病，但可通過自身免疫系統(tǒng)的建立，很快自愈。其臨床特點是急性濾泡性或假膜性結(jié)膜炎，伴有角膜上皮下浸潤，常由免疫反應(yīng)所引起。通常需要歷時一定時間才會吸收，長達數(shù)月、甚至數(shù)年潰瘍不會形成［9］，如果瞳孔區(qū)發(fā)生了病變，定會對該病人的視力造成的傷害較為嚴重。Jeng［10］等報道應(yīng)用環(huán)孢素聯(lián)合糖皮質(zhì)激素點眼對其進行治療較為理想，應(yīng)用環(huán)孢素進行治療會顯得更加有效、安全、無副作用。止匕外，環(huán)孢素多用于治療臨床中常見的干眼癥(DES)［11］，干眼癥多為種復(fù)雜原因所致淚液質(zhì)和量及動力學(xué)的異常從而導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定性和或眼表面異常、并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。在臨床方面用藥效果較好，可以有效緩解干眼等不適癥狀，且不良反應(yīng)小，可以長期使用。干眼癥又名角結(jié)膜干燥癥(KCS)，是因為眼表淚液減少、黏液分泌異常等原因引發(fā)的淚液蒸發(fā)較多，分布異常的綜合征。其大致可分為四種類型:①由于淚腺功能低下所致的水樣夜缺乏性干眼病;②由于沙眼、化學(xué)傷所致的黏性蛋白缺乏性干眼?。虎塾捎谘鄄€缺損、配帶角膜接觸鏡等導(dǎo)致淚液分布不均勻而引起淚液動力學(xué)異常；④由于瞼板腺功能障礙引起脂質(zhì)缺乏性干眼癥；在普通人群中的發(fā)病率為0.3%［12］，干眼癥的治療應(yīng)著手于去除病因，減少眼表和淚腺的炎癥，改善淚膜的結(jié)構(gòu)和功能。DES的發(fā)病率與多種因素有關(guān)，，其中50歲以上女性患病率約為男性的2倍。在某些疾病中，其發(fā)病率更高，如在糖尿病患者和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中分別為54.3%和46.7%［13］。環(huán)孢素滴眼液療效好，且無全身性不良反應(yīng)，近年來在歐美國家臨床得到了廣泛應(yīng)用。對于斯耶格倫氏綜合征（Sjorgren'ssyndrome）這類與炎癥相關(guān)的干眼癥，可使用環(huán)孢素等消炎藥進行治療［14］。各類臨床試驗也證明，使用環(huán)孢素滴眼液能增加患者眼淚量。環(huán)孢素較人造眼淚的療效要好，某些患者經(jīng)人造眼淚治療數(shù)月無效，但使用環(huán)孢素后效果顯著，且增強了患者角膜及結(jié)膜知覺的敏感度［15］?；加屑易逍缘矸蹣佣喟l(fā)性神經(jīng)病變的患者，通過環(huán)孢素治療后干眼癥狀明顯減輕，且無任何不良反應(yīng)［16］。環(huán)孢素的作用是有效緩解慢性干眼癥潛在的炎癥過程，局部應(yīng)用環(huán)孢素能阻止某些患者干眼進程，對治療干眼癥有良好的療效。滴眼劑是眼病治療常用途徑。環(huán)孢素具有脂溶性，易溶于植物油中，現(xiàn)如今環(huán)孢素的眼用劑型為普通乳劑型滴眼劑。由于環(huán)孢素的相對分子質(zhì)量大且呈疏水性，眼內(nèi)通透性差，難以達到治療水平，影響療效。微乳（microemulsion,ME）系指粒徑為10?100nm的乳滴分散在另一種液體介質(zhì)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體溶液。微乳一般在一定條件下可自發(fā)（或輕度振搖）形成，其乳滴多為大小比較均勻的球形，呈透明或半透明狀。微乳是由油相、表面活性劑（SF）、助表面活性劑（CoSF）以及水相組成的，在一定溫度長時間放置或離心（1300r/min，30min）均較穩(wěn)定。我們按照《中國藥典》關(guān)于溶液顏色檢查法的方法、澄清度檢查法以及制劑穩(wěn)定性指導(dǎo)原則的要求對該制劑的穩(wěn)定性進行長期試驗考察。按藥物制劑穩(wěn)定性重點考察項目，考察滴眼液性狀、可見異物、含量、PH值、有關(guān)物質(zhì)及無菌情況。為0.05%環(huán)孢素滴眼液的生產(chǎn)、包裝、貯存、使用條件提供科學(xué)依據(jù)。

2儀器與試藥儀器數(shù)顯無極恒速攪拌器 （鞏義市英峪予華儀器廠）日本島津產(chǎn)LC-10AVP型高效液相色譜儀SPD-10AVP型紫外檢測器LC-10AVP泵CTO-10AVP柱溫箱Class-up工作站Shim-packvp-ODS色譜柱（150mm*4.6mm）日本島津產(chǎn)紫外分光光度計UV-2450隔膜真空泵GM-0.33 （天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）電子分析天平AG135 （梅特勒-托利多儀器有限公司）實驗室pH計FE20ModelC3860A超聲儀滲透壓摩爾濃度測定儀SMC30B針頭式微孔濾膜過濾器一次性使用無菌注射器燈檢裝置實驗室pH計FE20ModelC3860A超聲儀滲透壓摩爾濃度測定儀SMC30B針頭式微孔濾膜過濾器一次性使用無菌注射器燈檢裝置A．B．C．D．（梅特勒-托利多儀器有限公司）（天河醫(yī)療儀器有限公司）（天津市雙吉色譜儀器經(jīng)營部）（浙江京環(huán)醫(yī)療用品有限公司）帶有遮光板的日光燈光源不反光的黑色背景；不反光的白色背景和底部反光的白色背景（指遮光板內(nèi)側(cè)）。溫度XMTA908光照強度XMTA808（重慶漢瞻儀器有限（天津天宇機電有限公司）藥品光照試驗箱公司）調(diào)溫調(diào)濕箱2.2試藥環(huán)孢素環(huán)孢素對照品大豆油聚乙二醇PEG400聚山梨酯80羥苯乙酯甲醇乙腈（福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號：140201（N））（中國藥品生物制品鑒定所，含量為98.8%）（新興（鐵嶺）藥業(yè)有限公司，批號：15050106-2-01藥品光照試驗箱公司）調(diào)溫調(diào)濕箱2.2試藥環(huán)孢素環(huán)孢素對照品大豆油聚乙二醇PEG400聚山梨酯80羥苯乙酯甲醇乙腈磷酸 （化學(xué)純，石家莊市試劑廠冀都化學(xué)試劑有限公司）水為純化水三乙胺為分析純0.05%環(huán)孢素滴眼液（自制三批：160203,160204,160205）色譜用試劑為色譜純，其他試劑為分析純，水為注射用水。3方法樣品的制備：取羥苯乙酯0.3g加入700ml純化水，加熱使之溶解，加入60ml聚乙二醇-400,攪拌，混勻；取0.5g環(huán)孢素至乳缽中，加10ml大豆油，80ml聚山梨酯80,充分研磨，倒入上述溶液中，快速攪拌，加純化水至1000ml，混勻，0.45pm微孔濾膜過濾,無菌分裝,即得。色譜條件及方法學(xué)研究：色譜條件：色譜柱： Shim-packvp-ODS色譜柱（150mm*4.6mm）流動相：乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.5）,用磷酸調(diào)pH至U2.93檢驗波長：210nm柱溫： 65°C流速： 1.2ml/min進流量： 飽和進樣進樣量： 20^L樣品預(yù)處理：取C&固相萃取小柱兩個，串聯(lián)使用并將其活化（活化順序為：甲醇-水-水18-甲醇，每次各5ml）,用5ml的移液管精密吸取樣品5ml至小燒杯中，用注射器全部吸取并緩慢打入小柱,收集濾液,用注射器二次吸取完全,再次通過小柱,棄去濾液，后用5ml純化水沖洗雜質(zhì)，再用乙腈、水的混合液（1：1）洗脫樣品于10ml的容量瓶中定容，混勻。過濾（孔徑0.45pm）,作為供試品。系統(tǒng)適應(yīng)性實驗：用移液管精密量取該樣品5ml,按照3.2.2的處理方法操作，再3.2.1的色譜條件下進樣,記錄色譜圖,計算理論塔板數(shù),分離度。比較標準品、樣品和空白微乳的色譜圖。標準曲線的繪制：精密稱取環(huán)孢素對照品25mg于50ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度使成儲備液。再分別精密移取儲備液3,4,5,6,7ml于10ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配成0.15,020.25,0.3,0.35Ng/ml的溶液，并按上述色譜條件分別進樣，記錄對應(yīng)的峰面積。以峰面積（Y）與對照品濃度（X）回歸，觀察其是否呈良好的線性關(guān)系,計算其回歸方程。制劑穩(wěn)定性的長期試驗考察：溶液的性狀：本品為淡黃色澄明液體。照《中國藥典》溶液顏色檢查法,配制黃綠色調(diào)標準比色液。分別取6℃±2℃條件下,于0月,1月,2月,3月的環(huán)孢素滴眼液樣品直接與標準比色液比較,樣品與標準色體積相等,同置白色背景前,平視觀察。3.3.2鑒別在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間分別一致。無菌情況的檢測：取本品0.05%環(huán)孢素滴眼液,采用薄膜過濾法處理,用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗（每膜不少于100ml）,以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依照法檢查（中國藥典）,應(yīng)符合規(guī)定。334PH和滲透壓的檢查：本品pH值應(yīng)在5.0?6.5之間，滲透壓摩爾濃度應(yīng)在290?430mOsmol/kg范圍內(nèi)。分別取6℃±2℃條件下0月,1月,2月,3月的0.05%環(huán)孢素滴眼液樣品適量，測定其pH值、滲透壓并觀察制劑理化性質(zhì)是否穩(wěn)定。可見異物檢查：分別取6℃±2℃條件下0月,1月,2月,3月的環(huán)孢素滴眼液樣品20支,去除容器標簽，把容器外壁清潔干凈，調(diào)節(jié)光照度至2000~3000lx，將供試品置于遮光板邊緣處，并在人眼的清晰觀測距離內(nèi)（約為25cm），分別置于黑色和白色背景下,手持供試品頸部輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使藥液中可能存在的可見異物懸?。ǖ珣?yīng)避免產(chǎn)生氣泡）,輕輕翻搖后即用目檢視,重復(fù)3次,總時限為20秒。樣品制劑在靜置一定時間后輕輕旋轉(zhuǎn)時應(yīng)無煙霧、狀微粒柱,且沒有檢出