細(xì)胞凋亡與檢測叢樂

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報告細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與檢測叢樂2005011007生51班實(shí)驗(yàn)組：周四班1-1組實(shí)驗(yàn)日期：2008年5月8日星期四~2008年5月10日星期六=1\*ROMANI．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解和掌握誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法。2．鞏固和提高細(xì)胞傳代、細(xì)胞培養(yǎng)、顯微鏡操作等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3．獨(dú)立完成細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和檢測過程，注意細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上發(fā)生的變化，從而更為深入地認(rèn)識細(xì)胞凋亡的過程和特點(diǎn)，并與文獻(xiàn)中的知識相互印證。=1\*ROMANI=1\*ROMANI.實(shí)驗(yàn)原理（略）=1\*ROMANI=1\*ROMANI=1\*ROMANI.實(shí)驗(yàn)材料、用具和試劑1.實(shí)驗(yàn)材料：HeLa細(xì)胞2.實(shí)驗(yàn)用具：熒光顯微鏡，顯微攝影系統(tǒng)，超凈操作臺，恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，恒溫水浴鍋，EP管，廢液缸，細(xì)胞培養(yǎng)平皿，移液器，酒精燈，火柴，鑷子，記號筆，酒精棉球，已滅菌槍頭，載玻片，蓋玻片。3.實(shí)驗(yàn)試劑：PBS緩沖液；DMEM培養(yǎng)基（DMEM+10%血清+1%雙抗，pH約7.2）；消化液（0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液）；H2O2溶液（8.8mmol/L）；固定液（甲醇溶液）；Hoechst33258染液（pH7.0左右）。=4\*ROMANIV．實(shí)驗(yàn)過程和操作步驟1．HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)和凋亡的誘導(dǎo)(注：傳代培養(yǎng)操作的具體步驟請參見“HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)報告)(1)取對數(shù)增長期的細(xì)胞，進(jìn)行鏡檢以觀察細(xì)胞密度和生長狀態(tài)。(2)加100μLH2O2母液至培養(yǎng)基中（原含1mLDMEM培養(yǎng)基），使其終濃度為0.8mmol/L。(3)24小時后收集細(xì)胞進(jìn)行染色和形態(tài)學(xué)觀察。2．Hoechst33258染色和細(xì)胞凋亡檢測(1)鏡檢細(xì)胞狀態(tài)，吸棄培養(yǎng)基，用1mLPBS溶液清洗細(xì)胞。(2)加入200μL的0.25%胰酶-EDTA混合液，在37oC消化3min左右，之后加入1mLDMEM培養(yǎng)終止消化。收集細(xì)胞至1.5mLEP管，1000g離心5min。(3)吸出上清，于沉淀中加入100L甲醇，室溫固定10min。(4)1000g離心5min。(5)棄上清，加100LPBS洗滌沉淀細(xì)胞。(6)1000g離心5min。(7)棄上清，加40LPBS和10LHoechst33258染液，于37℃避光染色10min。(8)1000g，離心5min。(9)棄上清，加100LPBS洗滌。(10)1000g，離心5min。(11)棄上清，加50LPBS重懸細(xì)胞。(12)取15L懸液于玻片上，加蓋蓋玻片后，在正置熒光顯微鏡下觀察，并拍照記錄。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將儀器、用具和材料收拾整齊，將桌面清理干凈。=4\*ROMANV．實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)和染色后，利用熒光顯微攝影系統(tǒng)進(jìn)行拍照，得到如下所示的細(xì)胞圖像：不同時期凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)通過Hoechst33258染液對細(xì)胞進(jìn)行染色之后，在熒光顯微鏡下可以觀察到處于不同時期凋亡細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，主要反映為細(xì)胞核中染色質(zhì)的變化，如下圖所示：Stage=1\*ROMANIStage=2\*ROMANIIaStage=2\*ROMANIIb圖1HeLa細(xì)胞不同凋亡時期的熒光顯微照片（1040=400倍，Hoechst33258染色，所有熒光照片均為紫外光激發(fā)拍攝，下同）圖中白色，黃色，和紅色箭頭分別指示凋亡過程中處于Stage=1\*ROMANI,Stage=2\*ROMANIIa,和Stage=2\*ROMANIIb的HeLa細(xì)胞。<圖1結(jié)果的分析和討論>由于Hoechst33258染色劑在實(shí)驗(yàn)條件下可特異結(jié)合DNA，在紫外（UV）光激發(fā)下可以發(fā)出藍(lán)色熒光，所以在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色。觀察染色質(zhì)形態(tài)，則可以判斷出細(xì)胞是否凋亡，以及各個凋亡細(xì)胞所處的時期。如圖1所示，從左到右分別是處于Stage=1\*ROMANI,Stage=2\*ROMANIIa,和Stage=2\*ROMANIIb的凋亡HeLa細(xì)胞。（1）Stage=1\*ROMANI：左側(cè)白色箭頭所指示細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有波浪狀紋理，說明部分染色質(zhì)發(fā)生濃縮和聚集。同時，可觀察到核內(nèi)存在空泡狀的結(jié)構(gòu)，稱為氣穴現(xiàn)象，以上這些形態(tài)學(xué)特征說明該細(xì)胞很可能處于凋亡時期中的Stage=1\*ROMANI。（2）Stage=2\*ROMANIIa：中間黃色箭頭所指示的細(xì)胞，其細(xì)胞核的染色質(zhì)高度濃縮，相較于Stage=1\*ROMANI細(xì)胞，其凝聚程度更高，并且其染色質(zhì)已經(jīng)邊緣化。綜上可知該細(xì)胞很可能為Stage=2\*ROMANIIa凋亡細(xì)胞；（3）Stage=2\*ROMANIIb：右側(cè)紅色箭頭所指示細(xì)胞中，核內(nèi)染色體已經(jīng)分裂為大小不等的碎塊，這表明細(xì)胞核已經(jīng)裂解，凋亡小體已經(jīng)產(chǎn)生。該細(xì)胞可判斷為處于Stage=2\*ROMANIIb的細(xì)胞。結(jié)合亮視場圖像對凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測和判斷利用亮視場的顯微照片，將之和熒光顯微鏡下的照片進(jìn)行對比（疊加），則可以清晰地檢測和判斷出每一個細(xì)胞的狀態(tài)以及所處的凋亡時期。如下圖所示：圖2HeLa細(xì)胞的熒光顯微照片和亮視場照片（1040=400倍，左側(cè)為熒光，右側(cè)為亮視場）紅色和黃色箭頭所指示細(xì)胞的具體說明請見下一頁中的分析和討論。圖3HeLa細(xì)胞熒光和亮視場顯微圖像疊加（1040=400倍）將亮視場圖像中背景透明化后，與熒光顯微圖像疊加所得，由于拍攝兩張照片時位置稍有偏差，所以將兩張圖像平移后進(jìn)行疊加。圖中通過亮視場圖像顯示細(xì)胞邊界和整體形狀，通過熒光顯微圖像顯示細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的形態(tài)，進(jìn)而可判斷細(xì)胞所處凋亡狀態(tài)。紅色和黃色箭頭所指示細(xì)胞的具體說明請見下一頁中的分析和討論。<圖2、圖3結(jié)果的分析和討論>如上一頁圖2和圖3所示，通過比對兩種觀察模式下的圖像，能夠提高我們對細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的觀察效果和對凋亡細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性。具體實(shí)例為：（1）疊加圖像有助于更深入了解凋亡細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化圖2中紅色箭頭所示的細(xì)胞。一方面，在熒光顯微圖像中，可見其細(xì)胞核染色質(zhì)已經(jīng)裂解為碎塊，可判斷出其處于Stage=2\*ROMANIIb。但是，此模式中沒有辦法看到細(xì)胞邊界，因此不能了解染色質(zhì)聚集裂解的范圍、分布和程度等信息。另一方面，同一細(xì)胞在圖2的亮視場圖像中，可以清晰看到細(xì)胞邊界和胞質(zhì)分布，但是細(xì)胞核染色質(zhì)狀態(tài)則無法顯現(xiàn)，因而無法檢測細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。圖3將兩者疊加，從而可通過熒光圖像檢測其凋亡狀態(tài)，又可通過細(xì)胞邊界信息了解到染色質(zhì)裂解后在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，從而更為深入地認(rèn)識凋亡過程中細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。（2）疊加圖像有助于更準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞所處的凋亡狀態(tài)圖2中兩個黃色箭頭所指示處在熒光圖像中似乎是兩個細(xì)胞的染色質(zhì)，但是在將熒光圖像和亮視場圖像疊加后，則可在圖3中發(fā)現(xiàn)這兩塊染色質(zhì)應(yīng)屬于同一個細(xì)胞。所以將兩者結(jié)合之后的凋亡檢測結(jié)果會更為清晰、準(zhǔn)確。此外，由于亮視場圖像提供了細(xì)胞邊界的信息，所以在判斷凋亡細(xì)胞所處時期（ApoptosisStage）時也具有很好的輔助作用。比如，判斷Stage=2\*ROMANIIa細(xì)胞的主要依據(jù)之一是：核內(nèi)染色質(zhì)高度濃縮和邊緣化。下圖4中白色箭頭所指示的細(xì)胞，如果單從沒有邊界信息的熒光圖像出發(fā)，很難判斷出其究竟是處于Stage=2\*ROMANI還是Stage=2\*ROMANIIa，但是如果將亮視場的圖像疊加后，則可以發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的染色質(zhì)發(fā)生明顯聚縮，因此可以判斷該細(xì)胞應(yīng)處于Stage=2\*ROMANIIa時期。圖4HeLa細(xì)胞熒光和亮視場顯微圖像疊加（1040=400倍）白色箭頭示Stage=2\*ROMANIIa期凋亡細(xì)胞特殊現(xiàn)象討論值得一提的是，在鏡檢時還可以觀察到兩種比較特殊的情況（見下一頁圖5和圖6）。圖5HeLa細(xì)胞熒光和亮視場顯微圖像疊加（1040=400倍，左側(cè)為熒光，右側(cè)為亮視場）黃色箭頭示一個疑似含有兩塊獨(dú)立染色質(zhì)的細(xì)胞<圖5中特殊現(xiàn)象的分析和討論>圖5中黃色箭頭所指的細(xì)胞在亮視場中可基本確定為單個橢圓形細(xì)胞，但是在熒光圖像中染色質(zhì)卻分離成為兩個相互獨(dú)立的區(qū)域，而且都有染色體濃縮的凋亡特征。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的可能原因如下：（1）圖中所示的仍然是兩個細(xì)胞的染色質(zhì)，只不過由于制片過程中兩個細(xì)胞相互擠壓，從而使得細(xì)胞間的界限不分明，所以導(dǎo)致在亮視場中兩細(xì)胞有一個共同的邊界。（2）或者，細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核分裂為兩個部分。（3）還有一種可能是該細(xì)胞在有絲分裂末期被固定，此時染色體分離但尚未解聚，兩細(xì)胞間的新的細(xì)胞邊界還沒有形成。另外，在熒光照片中還發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞的核內(nèi)具有染色體，而且可以大致分辨出姊妹染色單體的存在（如下圖6所示）。這可能是某些細(xì)胞在有絲分裂過程中被固定所致，也可能僅僅是正常凋亡后裂解的染色質(zhì)，只不過形狀湊巧類似染色體。圖6HeLa細(xì)胞熒光顯微照片（1040=400倍）紅色箭頭示疑似染色體=4\*ROMANVI．實(shí)驗(yàn)小結(jié)（1）實(shí)驗(yàn)操作中的經(jīng)驗(yàn)和總結(jié)<固定>為使得細(xì)胞充分接觸固定液，應(yīng)輕柔用移液器混合、懸浮細(xì)胞，以獲得較好的固定效果。<制作細(xì)胞懸液>在實(shí)際操作中，為防止直接吸干上清可能會損失一定量的細(xì)胞，所以我在最后一步離心后留下約15L的上清，加入20L的PBS溶液懸起細(xì)胞。這樣最后視野中細(xì)胞數(shù)量較多，更易觀察。<染色、制片和鏡檢>1．染色時時間可以稍長一些（本次實(shí)驗(yàn)使用15分鐘），并注意避光，這樣染色效果較好。2．制片時為防止長時間等待拍照而干片，可多取一些懸液，15~20L左右即可。3．在鏡檢時，可以先在低倍鏡下（10X或20X物鏡均可），定位到有較多染色質(zhì)已濃縮細(xì)胞的區(qū)域，然后轉(zhuǎn)換至高倍鏡頭下觀察和拍攝，這樣更容易找到較好的視野。（2）實(shí)驗(yàn)感想和收獲這次實(shí)驗(yàn)讓我第一次觀察到美麗而神奇的熒光染料的染色效果，同時第一次了解到凋亡細(xì)胞的有關(guān)特點(diǎn)。同時，這次實(shí)驗(yàn)使得我有機(jī)會動手驗(yàn)證了我們在細(xì)胞生物學(xué)課程中所學(xué)到的內(nèi)容（比如，細(xì)胞凋亡的定義和過程，凋亡細(xì)胞染色質(zhì)的變化、凋亡小體的形成及其特點(diǎn)等），從而讓我對相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)知識有了更加深入和直觀的理解。非常感謝助教老師在實(shí)驗(yàn)過程中對我們耐心