IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)步驟總結(jié)

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IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白

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配固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，滅菌。

配BindingBuffer和脫鹽液各500ml。在400ml體積時(shí)調(diào)理溶液pH值至7.4，定容后轉(zhuǎn)移到試劑瓶中。溶液使用前要抽濾（濾除溶液內(nèi)的氣泡和不溶性雜質(zhì)）。倒板：（5個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿）

①微波加熱溶解固體培養(yǎng)基（每次加熱30s，待有沸騰的跡象時(shí)，減少加熱的時(shí)間）。

②超凈臺操作，以1?1000的比例（1ml培養(yǎng)基~1μl抗生素）向培養(yǎng)基中參與Kan+抗生素(50mg/ml)，搖勻。

③倒板。

④培養(yǎng)皿放置在超凈臺上凝固，凝固后將培養(yǎng)皿倒著放入培養(yǎng)箱中。15-11-4

熱轉(zhuǎn)化：（將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中）

①提前將大腸桿菌（冰上溶化）和質(zhì)粒拿出來溶化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。

②42℃熱水浴1min（超過90s會損傷細(xì)菌），取出后馬上放在冰上冷卻2~3min，參與1mlSOC培養(yǎng)基。

③搖床上搖45min，150rpm，37℃。（使菌體復(fù)蘇）

④離心，3000rpm，3min。

⑤涂板：取200μl上述液體，噴到板上，用玻璃涂布棒涂勻，放入培養(yǎng)箱中30min晾干后倒著放置。（12~16h）15-11-5

配IPTG（0.2g/ml），用滅菌水，超凈臺操作。

挑單克?。海▽⒓?xì)菌放入培養(yǎng)液中，以便進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和后續(xù)試驗(yàn)）①提前準(zhǔn)備好幾支裝有3ml培養(yǎng)基的試管，每管參與3μlKan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，試管傾斜，是抗生素溶入培養(yǎng)液中。（塞子開啟前和塞好后都要在酒精燈上過火滅菌）。

②小鑷子過火滅菌后，夾取一個(gè)槍頭，在培養(yǎng)皿上挑一個(gè)單個(gè)的菌落，輕輕劃過。將帶有菌落的槍頭放入試管中，塞好塞子

③將試管放在搖床中培養(yǎng)一晚，37℃,250rpm。（盡量不超過12h）

注意：操作盡量在靠近酒精燈的地方進(jìn)行。15-11-6擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)

①以（抗生素?培養(yǎng)基）1?1000的比例向培養(yǎng)基中參與Kan+抗生素，搖勻后再參與（每100ml培養(yǎng)基）1ml單克隆溶液，搖勻。

②搖床上放置2.5h,37℃,180rpm。

③以48μlIPTG/100ml培養(yǎng)基的比例參與IPTG誘導(dǎo)，移去牛皮紙，恒溫?fù)u床上搖6h，30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制細(xì)胞生長速率，有利于蛋白質(zhì)充分折疊）

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離心收集細(xì)菌：將培養(yǎng)液倒入50ml離心管中，8000rpm,離心5min，棄上清。沉淀加水沖洗混勻，再離心，棄上清。加PBS沖洗混勻，離心，棄上清。加PBS混勻，將溶液移入PU管中，-20℃保存。15-11-7破碎、離心細(xì)胞

①4ml細(xì)胞液用超聲破碎3~4次（探頭不能碰見管底和管壁，且離管底1cm左右,4~7ml），至溶液透明。

②將溶液分裝到1.5ml離心管中，（10000rpm，4℃,10~15min）離心2~3次至沒有白色沉淀。蛋白質(zhì)純化脫鹽

①離心后得到的上清液用針筒抽取過膜，先后用鎳柱純化、脫鹽柱脫鹽（柱子不能干，不能有氣泡）。

兩者也可同時(shí)進(jìn)行鎳柱：水洗→Binding→加蛋白→Binding→Elution