微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)-(經(jīng)典)

微生物:

結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單，個(gè)體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2、類群1、特點(diǎn)現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期三病毒（無細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期三細(xì)菌

電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期三放線菌現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期三真菌青霉菌酵母菌現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期三原生生物現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期三微生物:1.特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).病毒細(xì)菌放線菌真菌原生生物2.微生物的類群無細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞真核細(xì)胞到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期三微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期三內(nèi)容提要：微生物及其分類培養(yǎng)基與各類營養(yǎng)物質(zhì)無菌技術(shù)菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期三一、培養(yǎng)基1、概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)?，F(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期三按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究2、分類現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期三按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長2、分類現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期三選擇培養(yǎng)基應(yīng)用加入青霉素加入高濃度食鹽不加氮源不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期三鑒別培養(yǎng)基:加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）鑒別大腸桿菌現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期三按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定2、分類現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期三一.培養(yǎng)基：3.基本營養(yǎng)：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽、生長因子（能源）⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源（3）能源現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期三一.培養(yǎng)基：（4）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物如：維生素、氨基酸、堿基等

生長因子：現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期三牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組分作用瓊脂20g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長因子碳源、氮源、生長因子、能源無機(jī)鹽水、溶劑現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期三4.培養(yǎng)基要滿足微生物對環(huán)境條件的需求

：真菌微酸性（5.0-6.0）細(xì)菌中性（6.5-7.5）放線菌微堿性（7.5-8.5）大多數(shù)微生物適宜生長的溫度在25-40℃之間厭氧菌需提供無氧條件pH：溫度：氧氣：現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期三（1）滅菌：

使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。二.無菌技術(shù)：泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來雜菌的污染的方法現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期三灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期三

（2）消毒：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）煮沸消毒法：100℃5-6min巴氏消毒法：70-75℃30min或80℃15min化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線消毒：實(shí)驗(yàn)前30min現(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期三煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑（70%酒精等）紫外線針對不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基消毒方法滅菌方法實(shí)驗(yàn)操作者的衣服現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期三單個(gè)或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：三.菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期三四、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）計(jì)算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化調(diào)pH(注意：滅菌前調(diào)PH)分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期三倒平板技術(shù)1234使瓶口迅速通過火焰在火焰旁打開錐形瓶打開一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入約10-20ml倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固后倒置現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期三1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。問題討論現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期三

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基?，F(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期三3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期三

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物?，F(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期三四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：⑴平板劃線法：2.接種：交叉劃線法連續(xù)劃線法現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期三將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞將試管口通過火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。.將試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期三問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者?，F(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期三6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期三b.涂布平坂取0.1ml菌懸液微量移液器現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期三將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12h-24h,直到長出菌落為止。3、培養(yǎng)現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期三Pourplate(3).稀釋倒平板法現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期三四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：1.制備培養(yǎng)基2.接種：3.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期三4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察5、菌株的保存方法固體斜面培養(yǎng)基甘油管藏臨時(shí)保存：長期保存：擱置斜面現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期三微生物數(shù)量的計(jì)算直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期三（一）直接計(jì)數(shù)法

——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡單缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)需要相對高的細(xì)菌濃度個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期三1、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺，中央平臺又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室體積為l×0.1＝0.1mm3。(注意：1ml＝1000mm3)現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期三****#####血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室有兩種刻度1大格=16中格25×16=400小格1大格=25中格16×25=400小格現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期三1、稀釋用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。2、鏡檢計(jì)數(shù)室加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則用自來水沖洗，95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。3、加樣取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，靜置5min。注：取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生2、操作步驟現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期三4、顯微鏡計(jì)數(shù)（以16小格×25中格的規(guī)格為例）在高倍下(40X)計(jì)數(shù)對兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個(gè)菌體為宜計(jì)數(shù)的結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5、清洗血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止?，F(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期三3、計(jì)數(shù)方法所統(tǒng)計(jì)的5個(gè)中格的總菌數(shù)A，菌液的稀釋倍數(shù)為B，則1ml菌液含有的菌數(shù)為：

1大格子=25中格現(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期三（二）間接計(jì)數(shù)法

——稀釋平板計(jì)數(shù)法將待測樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經(jīng)過培養(yǎng)，由單個(gè)微生物生長繁殖而形成肉