枯草桿菌生物興趣小組

目錄1、認(rèn)識(shí)枯草桿菌2、革蘭氏染色法3、枯草桿菌的培養(yǎng)4、枯草桿菌的培養(yǎng)現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四認(rèn)識(shí)枯草桿菌現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草芽孢桿菌

（枯草桿菌一般指枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四水上形態(tài)在枯草桿菌豐富的水體里，水的表面張力比較大，可以在吹出來(lái)的泡泡的小圈上形成一層膜?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草桿菌培養(yǎng)基電鏡圖片形態(tài)特征現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四革蘭氏染色法現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四細(xì)菌介紹芽孢具有厚而致密的壁，透性差，含水量低，折光性強(qiáng)，不易著色。在加熱條件下加入著色力強(qiáng)的染料，讓芽孢、菌體與染料作用較長(zhǎng)時(shí)間，使芽孢染上顏色，再使菌體的顏色脫去；然后再用另一種與前者顏色不同的對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使芽孢和菌體分別呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，以便觀察。莢膜是一層覆蓋在某些細(xì)菌細(xì)胞壁表面的粘性物質(zhì)，主要成分是多糖類(lèi)。莢膜與染料的親合力較差，不易著色。莢膜的通透性好，某些染料可透過(guò)莢膜而使菌體著色。因此，常采用負(fù)染色法將菌體和背景著色而莢膜不著色，因而莢膜在菌體周?chē)室煌该鳠o(wú)色圈。細(xì)菌鞭毛非常纖細(xì)，直徑10-20nm，只能在電子顯微鏡下才能觀察到。但采用特殊的染色法在光學(xué)顯微鏡下也能見(jiàn)到。其原理是：在染色前先用媒染劑處理，使媒染劑沉積在鞭毛上，將鞭毛加粗，然后再進(jìn)行染色，便能在油鏡下看見(jiàn)鞭毛的形狀和著生方式。

現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四原理現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四基本原理革蘭氏染色法是一種鑒別性的染色方法。結(jié)果細(xì)胞保留初染劑籃紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌；如果細(xì)胞為復(fù)染劑的顏色（紅色），則為革蘭氏陰性菌。其機(jī)理是由于細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)不同和通透性不同的緣故。細(xì)菌的革蘭氏染色受菌齡、培養(yǎng)基pH值和染色技術(shù)等因素的影響，并非固定不變?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四三、器具材料

1.器材：顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、接種環(huán)、酒精燈、火柴、吸水紙、載破片、蓋玻片。2.染色液及試劑:結(jié)晶紫染色液、路戈氏碘液、95%的酒精、番紅染色液、蒸餾水。

堿性復(fù)紅染色液、5%孔雀綠染色液。3.菌種；培養(yǎng)18小時(shí)至20小時(shí)的枯草芽孢桿菌、蘇云金桿菌、大腸桿菌的新鮮斜面菌種。培養(yǎng)24小時(shí)至36小時(shí)的枯草桿菌或蘇云金桿菌、巨大芽孢桿菌?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染,在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、

取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用marker筆畫(huà)一個(gè)小圈（用來(lái)大致確定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、

涂片：

液體培養(yǎng)基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開(kāi)管蓋；右手持接種環(huán)在火焰中燒灼滅菌，等冷卻后從試管中沾取菌液一環(huán)，在潔凈無(wú)脂的載玻片上涂直徑2mm左右的涂膜，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

固體培養(yǎng)基：先在載玻片上滴一滴無(wú)菌水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。

3、

晾干：讓涂片在空氣中自然干燥。

4、

固定：讓菌膜朝上，通過(guò)火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。5、

染色：將固定過(guò)的涂片放報(bào)紙上，滴加草酸銨結(jié)晶紫液，染1min。

6、

水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。簡(jiǎn)單染色結(jié)束可觀察細(xì)胞形態(tài)。

8、

脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無(wú)紫色，立即水洗。

9、

復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結(jié)束。

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四觀察莢膜和鞭毛標(biāo)本片周生莢膜一端生一束現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草桿菌繁殖現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四1.1培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸餾水，pH7.2—7.5。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g瓊脂,1000mL蒸餾水，pH7.2—7.5。1號(hào)培養(yǎng)基：3g木屑,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。2號(hào)培養(yǎng)基：3g稻草,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。3號(hào)培養(yǎng)基：3g玉米芯,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。4號(hào)培養(yǎng)基：3g糠殼,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四為了更好地探究枯草桿菌繁殖的適宜條件，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化：1.2培養(yǎng)基的優(yōu)化1.2.1培養(yǎng)方法1.2.2檢測(cè)方法1.2.3含水量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響1.2.4稻草粗細(xì)程度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響1.2.5氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響1.2.6碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響1.2.7碳氮比對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響1.2.8pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四1.2.1培養(yǎng)方法先用接種環(huán)接種1環(huán)試管菌種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，200r/min，37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，然后再取1mL液體種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四檢測(cè)方法活菌的檢測(cè)方法：稱量大概5g發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基溶解在50mL無(wú)菌水中,200r/min，20min搖散得10，再用5mL無(wú)菌吸管吸取5mL到45mL無(wú)菌水中，搖勻得10，依次這樣稀釋到一個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尪?，?.1mL稀釋液到無(wú)菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)24h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)[7]。芽孢率的檢測(cè)方法：稱量大概5g發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基溶解在50mL無(wú)菌水中,200r/min，20min搖散得10，再用5mL無(wú)菌吸管吸取5mL到45mL無(wú)菌水中，搖勻得10，依次這樣稀釋到10，取0.02mL滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€(gè)清晰的畫(huà)面，數(shù)畫(huà)面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率?，F(xiàn)在是19頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四1.2.3含水量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響麥麩與稻草的比例確定以后，即可得其含水量為67%，分別以75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在其它成分和條件不變的情況下培養(yǎng)48h，檢測(cè)各處理后的活菌數(shù)和芽孢率，計(jì)算得其單位質(zhì)量的干重的發(fā)酵培養(yǎng)基的芽孢數(shù)，以確定最佳的含水量。1.2.4稻草粗細(xì)程度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響分別以稻草粗細(xì)程度為<0.5mm,0.5～1.0mm,1.0～1.5mm,>1.5mm,混合樣作為發(fā)酵培養(yǎng)基，其它組分不變，相同發(fā)酵條件下培養(yǎng)48h,檢測(cè)各的活菌數(shù)和芽孢率，以確定稻草的最佳粗細(xì)程度。1.2.5氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響在相等的N含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母膏，豆餅粉，尿素，（NH）SO及不同組合作為N源，其它成分不變，相同條件下培養(yǎng)48h,檢測(cè)活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳N源?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四1.2.5碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響確定N源后，在保持C含量不變的情況下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為C源制作發(fā)酵培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下培養(yǎng)48h，測(cè)定活菌數(shù)和芽孢率，確定最佳C源。1.2.7碳氮比對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原料質(zhì)量比)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其它成分不變，在相同的條件下培養(yǎng)48h，檢測(cè)發(fā)酵料中和活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳的C/N比。1.2.8pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH值，分別以pH值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5作為發(fā)酵培養(yǎng)基，其它成分不變，在相同的發(fā)酵條件下培養(yǎng)48h，檢測(cè)活菌數(shù)和芽孢率，得最佳pH。現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草桿菌的應(yīng)用現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四……在生活中的應(yīng)用現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四1.枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用

現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草芽孢桿菌在生物防治領(lǐng)域中的應(yīng)用枯草芽孢桿菌作為植物病害生防細(xì)菌之一，具有較強(qiáng)的防病作用。美國(guó)用枯草芽孢桿菌QST713菌株開(kāi)發(fā)出活菌制劑殺菌劑SerenadeTM，用于防治多種作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害，用于防治葉部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麥白粉病，還可作為增產(chǎn)促進(jìn)劑。澳大利亞開(kāi)發(fā)的B.subtilisA-B對(duì)麥類(lèi)和胡蘿卜立枯病等具有很好的防治和增產(chǎn)作用。現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四2.枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類(lèi)，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長(zhǎng)現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四研究證明，枯草芽孢桿菌的活菌制劑可以作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也用來(lái)預(yù)防和治療燒傷面的感染。最近，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌提取到的淀粉酶、纖維素酶能夠補(bǔ)充體內(nèi)消化酶的不足，恢復(fù)正常消化機(jī)能；蛋白酶能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周?chē)膲木?、腐肉和碎屑。日本人日常生活中食用的納豆就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，研究表明，納豆中含有的溶栓酶(納豆激酶)對(duì)心血管疾病有很好的預(yù)防和治療作用；而同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸可用作藥物緩釋材料和醫(yī)用高分子纖維材料等?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四英文名稱：CombinedBacillusSubtilisandEnterococcusFaeciumGranuleswithMultivitamines，Live是否處方藥：非處方藥劑型：顆粒藥品類(lèi)型：生物制品通用名稱：枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒化學(xué)成分：每袋(1克)含活菌凍干粉37.5毫克,內(nèi)有活菌1.5億個(gè)。含有兩種活菌—枯草桿菌和腸球菌，可直接補(bǔ)充正常生理菌叢，抑制致病菌，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，抑制腸源性毒素的產(chǎn)生和吸收，達(dá)到調(diào)整腸道內(nèi)菌群失調(diào)的目的。本品還有嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育所必須的多種維生素、微量元素及礦物質(zhì)鈣，可補(bǔ)充因消化不良或腹瀉所致的缺乏。藥理作用現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四3.刺激動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四4．枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類(lèi)，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類(lèi)一同發(fā)揮作用。現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四枯草芽孢桿菌在工業(yè)酶生產(chǎn)中的應(yīng)用枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)十分豐富，這決定了其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應(yīng)用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。在過(guò)去的10年，利用基因工程技術(shù)，枯草芽孢桿菌幾乎可以在短期內(nèi)大量生產(chǎn)任何種源的新酶，從而省略了大量的原始菌種改造、馴化、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)等工作；利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，能夠在生產(chǎn)新酶之前對(duì)該酶的性質(zhì)進(jìn)行改良和調(diào)整，從而改善酶的活性或者賦予酶新的所需性質(zhì)。這些新技術(shù)的應(yīng)用使新酶種的開(kāi)發(fā)周期大大縮短，難度和成本降低，產(chǎn)品更加穩(wěn)定有效。現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四5．能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四What'smore現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期四

枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的應(yīng)用枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用起步較晚，由于它能分泌蛋白酶等多種酶類(lèi)和抗生素，使池底積累的大量殘余餌料、排泄廢物、動(dòng)植物殘?bào)w以及有害氣體(氨、硫化氫等)，使之先分解為小分子(多肽、高級(jí)脂肪酸等)，后分解為更小分子的有機(jī)物(氨基酸、低級(jí)脂肪酸、單糖、環(huán)烴等)，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽和硫酸鹽等，從而有效地改善水質(zhì)，同時(shí)還能為以單細(xì)胞藻類(lèi)為主的浮游植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)繁殖。這