單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)液概要

第六節(jié)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)液藻類的生長(zhǎng)繁殖需要吸收各種營(yíng)養(yǎng)元素，單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)液必須具備這些營(yíng)養(yǎng)元素,而且在營(yíng)養(yǎng)成分和數(shù)量上都應(yīng)該符合藻類的需要，各種藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要有很多共同點(diǎn)，所以一些培養(yǎng)液配方，能應(yīng)用于多種藻類的培養(yǎng)。然而，藻類的不同種類，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求是有差別的，各有其特殊性，不同種類的培養(yǎng)液配方，當(dāng)然也應(yīng)該不同。只有較好地符合培養(yǎng)種類需要的配方，才可能獲得較理想的效果。一個(gè)培養(yǎng)液配方的提出，首先必須了解這種藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求，要達(dá)到這一點(diǎn)，進(jìn)行一系列的試驗(yàn)是必要的。還必須在使用中驗(yàn)證配方的效果，并在實(shí)踐過程中不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，加以改進(jìn)，使配方達(dá)到更理想的水平。本節(jié)內(nèi)容分培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)液配方和培養(yǎng)液的配制三部分。一、培養(yǎng)液成分單細(xì)胞藻類培養(yǎng)液的成分有下列七類。(一)大量元素1．氮(N)單胞藻培養(yǎng)液常用的氮源有硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈉(NaNO3)、尿素(NH2CONH2)、硝酸銨(NH4NO3)、硝酸鈣[Ca(NO)3)2]、氯化銨(NH4C1)、硫酸銨[(NH4)2SO4]、發(fā)酵人尿……等。其中以硝酸鈉和硝酸鉀最常用。但不同的藻類對(duì)硝酸態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收利用情況是不同的，必須根據(jù)不同的藻類選擇合適的氮源。2．磷(P)單胞藻培養(yǎng)液常用的磷源有磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸二氫鈉、(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)4種。海水單胞藻培養(yǎng)液應(yīng)用磷酸二氫鉀，如用磷酸氫二鉀所配培養(yǎng)液會(huì)產(chǎn)生大量沉淀。3．鐵(Fe)單胞藻培養(yǎng)液常用的鐵源有三氯化鐵(FeCl3)、硫酸鐵(FeSO4)、硫酸高鐵[Fe2(SO4)3]、氧化鐵(FeO)、檸檬酸鐵(FeC6H5O7)、檸檬酸鐵銨[Fe(NH4)3(C6H5O7)]等。其中最常用的是三氯化鐵和檸檬酸鐵。無機(jī)鐵在水中容易形成一種膠體復(fù)合物，無可逆反應(yīng)，不能為生物利用。鐵也容易產(chǎn)生沉淀。所以盡管鐵在數(shù)量上所需很少，但要滿足藻類需要卻很困難。要保持溶液中可利用態(tài)鐵的數(shù)量，通常采用3種方法，這些方法都取得一定的成功，但都不夠十分完善。(1)在培養(yǎng)液內(nèi)加入土壤抽出液：由于自然有機(jī)質(zhì)(一般稱為腐殖酸)的作用阻止了鐵的沉淀和溶膠化(Pringsheim，1963)。(2)在培養(yǎng)液內(nèi)加入某種有機(jī)酸或其鹽類以形成可溶性鐵化合物：已證明較有效的有檸檬酸鹽和酒石酸鹽：邁爾(Myers，1947)證實(shí)應(yīng)用硫酸鐵和檸檬酸鈉能使小球藻生長(zhǎng)十分良好。(3)應(yīng)用絡(luò)合劑：最常用的為乙二胺四乙酸(EDTA)，絡(luò)合劑能防止鐵和微量營(yíng)養(yǎng)元素沉淀，并按照質(zhì)量作用定律釋放出足夠數(shù)量的離子供藻細(xì)胞利用。由于無機(jī)鐵容易形成膠體復(fù)合物和沉淀，而有機(jī)鐵，如檸檬酸鐵、酒石酸鐵等則是可溶性的，易為藻類細(xì)胞利用，在培養(yǎng)液配方中可使用有機(jī)態(tài)鐵代替無機(jī)態(tài)鐵。因藻類對(duì)鐵元素需要量不大，也有部分科學(xué)工作者，把鐵列為微量元素。4．鉀(K)單胞藻培養(yǎng)液中鉀的來源常用的有氯化鉀(KCl)、硝酸鉀(KNO3)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)等。一般培養(yǎng)液中由于氮、磷元素的加入，也附帶加入了鉀營(yíng)養(yǎng)元素。除此以外，可再加入氯化鉀。5．鎂(Mg)培養(yǎng)液中鎂的來源，常用的是硫酸鎂(MgSO4)和氯化鎂(MgCl2)兩種?？梢詥为?dú)使用其中一種，也可兩種同時(shí)使用。鎂元素在天然海水中的含量很大(1200mg/L以上)，一般是足夠的。①湛水101號(hào)培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO30.03g維生素B1200μgCo(NH2)20.03g維生素B12200mμgKH2PO40.005g人尿1.5mlFeC6H5O7(1%溶液)0.2ml

海水1000ml培養(yǎng)綠藻類、金藻類、硅藻類……使用。在培養(yǎng)硅藻時(shí)應(yīng)加入0.02g/L硅酸鈉。②ASP2培養(yǎng)液[Provasoli,L.;McLaughlin,J.J.A.;Droop,M.R.1957]:NaCl1.8gNnCl20.12mgMgSO4·7H2O0.5gCoCl20.3μgKCl0.06gCuCl20.12μgCaC1210.0mgH3BO30.6mgNaNO35.0mg維生素B120.1μgK2HPO40.5mg維生素溶液S3（參考第70頁）1.0mlNa2SiO3·10H2O15mgNa2EDTA3.0mg三[羥甲基]氨基甲烷0.1mgFeCl30.08mg純水100mlZnCl315μgpH7.6~7.8培養(yǎng)綠藻類、金藻類、藍(lán)藻類、隱藻類、渦鞭藻類使用。（2）綠藻培養(yǎng)液配方：①海洋三號(hào)扁藻培養(yǎng)液（海洋研究所，1960）：NaNO30.1g2Na3C6H5O7·11H20.02gKH2PO40.01gFe(SO4)3(1%溶液)10滴

海水1000ml②亞心形扁藻培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO30.05g維生素B12200mμgKH2PO40.005g人尿2mlFeC6H5O7(1%溶液)0.2ml維生素B1200μg

海水1000ml培養(yǎng)成亞心形扁藻及其他綠藻使用，多用于小型培養(yǎng)和中繼培養(yǎng)，如能加入海泥抽出液20ml，效果更好。③亞心形扁藻培養(yǎng)液（廈門水產(chǎn)學(xué)院）：（NH4）2SO4200mg海泥抽出液V（參考第60頁）20ml過磷酸鈣[Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O)]30mgFeC6H5O7(1%溶液)0.5ml

海水1000ml過磷酸鈣溶液的配制：取含有效磷為16%的普通二級(jí)過磷酸鈣配成3%的母液，過濾，使用時(shí)每1000ml海水加入1ml。培養(yǎng)過程中以追肥形式分2次加入0.2%人尿液效果更好。④布徹（Butcher）培養(yǎng)液[Butcher，（1959）]：NaNO30.1g土壤抽出液50mlK2HPO40.05g海水1000ml培養(yǎng)扁藻使用。⑤鹽藻培養(yǎng)液：甲液：K2HPO40.05gNaCl5~10gFeC6H5O70.001g海水500ml海泥抽出液V（參考第60頁）20~30ml乙液：海水500mlNaNO30.5g使用時(shí)，將甲、乙兩液混合。如果再加入0.2%~0.3%人尿，效果更好。⑥赫特納（Hutner）培養(yǎng)液[Hutner,S.H.(1950)]：NaCl0.25~4gK2HPO420mgMgSO4·7H2O0.25g醋酸鉀0.2gCa(NO3)2·4H2O15mg甘氨酸0.25gEDTA0.05gZn3.0mgFe0.6mgCu0.5mgMn1.0mg純水100mlMo1.0mgpH7.5培養(yǎng)鹽藻使用。⑦賴瑟（Ryther）培養(yǎng)液[Ryther，J.(1954)]:NaCl2.67gNa3HPO4·12H2O2.0mgMgCl2·6H2O0.22gNa2SiO3·9H2O2.0mgMgSO4·7H2O0.32gNa2C6H5O7·2H20.02mgKCl73mgKBr5.8mgNaHCO320mgB1.0mgNH4Cl5.3mg純水100mlCaCl2150mg培養(yǎng)微綠球藻和Stichococcus使用。⑨屋島改良培養(yǎng)液（平田八郎，1980）：過磷酸鈣[Ca(H2PO4)2·H2O]+2(CaSO4·H2O)50g硫酸銨（NH4）2SO4300g海水1m大量培養(yǎng)海產(chǎn)小球藻使用。（3）硅藻培養(yǎng)液配方：①艾倫—內(nèi)爾森（Allen-Nelson）培養(yǎng)液[Allen,E.J.etal(1910)]:A.KNO320.2g純水100mlB.Na2HPO4·12H2O4.0gCaCl2·6H2O4.0gHCl(濃)2.0ml純水80mlFeCl32.0mlB液的配制法：先把氯化鈣4g溶解于40ml純水中。另外把磷酸氫二納4g溶解40ml純水中，再把三氯化鐵溶融液2ml，緩慢滴入，搖動(dòng)，產(chǎn)生白色沉淀，加熱，緩滴入濃鹽酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上兩溶液混合。使用時(shí)，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加熱消毒，消后靜置24h，然后將上層清液倒出使用。②盧因（Lewin）培養(yǎng)液[Lewin,J.C.;Lewin,L.A.(1960)]:Ca(NO3)2·4H2O0.02gZn0.1mgK2HPO40.05gB0.1mgNa2SiO3·9H2O0.5mgCo0.1mg胰蛋白1.0gCu0.1mg維生素B121.0μgMo0.1mgFe0.3mg海水1000ml③米奎爾（Miquel）培養(yǎng)液[Miquel,P.(1890~1893)]:A.MgSO410gKI0.2gNaCl10g純水100mlNa2SO45gB.Na2HPO4·12H2O4gNH4NO31gCaCl2·6H2O4gKNO32gFeCl3(溶融)2mlNaNO32gHCL(濃)2mlKBr0.2g純水80ml每1000ml海水加入A液2ml，B液1ml。④須藤培養(yǎng)液[須藤俊造（1959）]：NaCl24gNaHCO30.168gMgSO4·7H2O8gNa2SiO30.008gKCl0.7gP1（參考第70頁）1mlCaCl2·2H2O0.37g維生素B120.02μgNaNO30.1gNa2HPO4·12H2O0.125g純水1000ml培養(yǎng)中肋骨條藻使用。⑤廖氏改良培養(yǎng)液（轉(zhuǎn)引自張立言等，1989）：KNO360mgNaSiO310mgNa2HPO4·12H2O10mg海水1000ml培養(yǎng)中脅骨條藻用。⑥中脅骨條藻培養(yǎng)液（廈門大學(xué)）：KNO30.4gNaSiO30.02gNa2HPO4·12H2O0.04gFeSO4·7H2O0.014g土壤抽出液15ml4~5國(guó)際單位“920”植物生長(zhǎng)刺激素海水1000ml⑦硅藻培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO30.08g維生素B1200μgK2HPO40.008g維生素B12200mμgFeC6H5O7(1%溶液)0.2ml人尿1.5mlNa2SiO30.02g海水1000ml培養(yǎng)三角褐指藻、小新月菱形藻、鈣質(zhì)角毛藻、牟氏角毛藻使用。⑧牟氏角毛藻培養(yǎng)液（黃海水產(chǎn)研究所）：NH4NO35~20mgFeC6H5O7·3H2O0.5~2.0mgKH2PO40.5~1.0mg海水1000ml⑨小新月菱形藻培養(yǎng)液（朱樹屏等，1964）：NO3—N4gFe(FeC6H5O7·3H2O)0.04gPO4—P0.4g海水1m⑩赫特納（Hutner）培養(yǎng)液[Hutner,S.H.(1948)]:NaCl0.2gMn0.05μgMgSO4·7H2O0.25gMo5.0μgNH4NO350mgZn5.0μgCaCO314mgCu5.0μgK2HPO440mgB0．05μgNa2SiO3·9H2O5mg純水100mlNa3C6H5O7·2H2100mgFe0.5mgpH7.2~7.5培養(yǎng)三角褐指藻使用。（4）金藻培養(yǎng)液配方：①E—S培養(yǎng)液（Allen,M.B.）:NaNO30.12g土壤抽出液I（參考第60頁）50mlK2HPO40.001g海水1000ml培養(yǎng)等鞭藻Isochrysisgalbana使用。②F/2培養(yǎng)液（Guillardetal.,1962）:NaNO374.8mgF/2微量元素溶液（參考第70頁）1mlNaH2PO44.4mgF/2維生素溶液（參考第71頁）1mlNa2SiO3·9H2O8.4~16.7mg海水1000ml小型培養(yǎng)金藻使用。③F/2改良培養(yǎng)液（廈門水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO374.8mg人尿1.5mlNaH2PO44.4mg海水1000ml海泥抽出液V（參考第60頁）20~60ml生產(chǎn)性培養(yǎng)金藻使用。④等鞭藻OA—3011培養(yǎng)液（陳椒芬等，1987）：NaNO360mg維生素B120.5~1.5μgKN2PO44mg維生素B1100~500μgFeC6H5O70.5mgNaHCO31gNa2SiO35mg海水1000ml⑤湛水107—13培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO380mg維生素B120.5~1.5μgK2HPO48mgNaHCO31gFeC6H5O7（1%溶液）0.2mg維生素B1200μg海水1000ml培養(yǎng)湛江等鞭藻、亞心形扁藻、鈣質(zhì)角毛藻使用。⑥湛水107—18培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學(xué)院）：NaNO350mg維生素B120.5~1.5μgK2HPO45mg人尿1.5mlFeC6H5O7（1%溶液）0.2mlNaHCO30.5g維生素B1200μg海水1000ml培養(yǎng)湛江等鞭藻、亞心形扁藻、鈣質(zhì)角毛藻使用。⑦等鞭藻9201培養(yǎng)液（周汝倫等，未發(fā)表）：Co(NH2)230mg/L維生素B10.2mg/LNaNO330mg/L維生素B120.0005mg/lKH2PO48mg/LFeC6H5O70.5mg/L海水培養(yǎng)等鞭藻9201品系使用。⑧綠色巴夫藻培養(yǎng)液（陳椒芬，未發(fā)表）：NaNO360g維生素B1100mgKH2PO44g維生素B120.5mgFeC6H5O70.5gNa2SiO3·9H2O5g海水1m⑨異膠藻培養(yǎng)液Ⅰ（陳世杰，1979）：（NH4）2SO410~20mgFeC6H5O70.1~0.2mgKH2PO41~2mg海水1000ml⑩異膠藻培養(yǎng)液Ⅱ（陳世杰，1979）人尿3~5ml海水1000ml大量培養(yǎng)使用。2．淡水單胞藻培養(yǎng)液配方（1）一般用培養(yǎng)液配方：①朱氏10號(hào)培養(yǎng)液（朱樹屏，1942）：Ca(NO3)20.04gNa2SiO30.025gK2HPO40.01~0.05gFeCl30.0008gMgSO4·7H2O0.025gNa2CO30.02g淡水1000ml培養(yǎng)浮游藻類使用，以海水代替淡水可用于培養(yǎng)海產(chǎn)藻類。②諾普（Knop）改良培養(yǎng)液[Pringsheim,E.G.(1949)]:KNO31.0gMgSO4·7H2O0.1gCa(NO3)20.1gFeCl30.001gK2HPO40.2g淡水1000ml（2）綠藻培養(yǎng)液配方：①水生4號(hào)培養(yǎng)液（黎尚豪等，1959）：（NH4）2SO40.2gKCl0.025g過磷酸鈣[Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O)]0.03gFeSO4(1%溶液)0.15mlMgSO4·7H2O0.08g土壤抽出液Ⅳ（參考第60頁）0.5mlNaHCO30.10g淡水1000ml培養(yǎng)斜生柵藻（Scenodesmusobliquus）和蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）使用。②水生6號(hào)培養(yǎng)液（黎尚豪等，1959）：NH2CONH20.133gFeSO4(1%溶液)0.200mlH2PO40.33mlCaCl20.030gMgSO4·7H2O0.100g土壤抽出液Ⅳ（參考第60頁）0.500mlNaHCO30.100gKCl0.033g淡水1000ml培養(yǎng)種類同水生成號(hào)，使用水生6號(hào)培養(yǎng)液培養(yǎng)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖比使用水生成號(hào)迅速。③布里斯托爾（Bristol）培養(yǎng)液[Bristol,B.M.(1920)]:NaNO30.5gNaCl0.05gKH2PO40.5gFeCl3·6H2O0.01gMgSO4·7H2O0.15gCaCl20.05g淡水1000ml培養(yǎng)綠藻類使用。（3）硅藻培養(yǎng)液配方：①水生硅1號(hào)培養(yǎng)液（水生生物研究所藻類研究室藻類應(yīng)用組[76]，1975）：NH4NO3120mgNa2SiO3100mgMgSO4·7H2O70mgCaCl220mgK2HPO440mgNaCl10mgKH2PO480mgFeC6H5O75mgMnSO42mg淡水1000ml培養(yǎng)泉生偏縫藻（NitzschiafonticolaGrun.），椿狀偏縫藻（NitzschiapaleaSmith）,雙尖菱板藻（HantzschiaamphioxysGrun.），梅尼小環(huán)藻（CyclotellameneghinianaKutz.）使用。②水生硅2號(hào)培養(yǎng)液（水生生物研究所藻類研究室藻類應(yīng)用組[76]，1975）：NH2CONH2150mgNaHCO3100mg過磷酸鈣[Ca(H2PO4)2·H2O+2（CaSO4·H2O50mgMnSO43mgMgSO4·7H2O50mgEDTA-Fe1mlKCl30mg土壤抽出液Ⅳ（參考第60頁）4mlNa2SiO3100mg淡水1000ml培養(yǎng)種類同水生硅1號(hào)，大量培養(yǎng)使用。③福格（Fogg）培養(yǎng)液[Fogg,M.B.,(1956)]:Ca(NO3)20.8gNa2SiO30.025gK2HPO40.01gFeC6H5O70.0008gMgSO4·7H2O0.025g土壤抽出液Ⅰ（參考第60頁）20mlNa2CO30.02g純水1000ml培養(yǎng)舟形藻(Nauiculapelliculosa使用)。（4）藍(lán)藻培養(yǎng)液配方：①B.G.M.培養(yǎng)液（Allen,M.B.）:KNO32.02gK2HPO40.35gMgSO4·7H2O2.46gA8（參考第70頁）3.0mlNaCl2.30gCaCl20.07g純水1000ml培養(yǎng)一般藍(lán)藻用。②扎魯克（Zarrouk）培養(yǎng)液（PinnanSoong,1980）:NaHCO316.8gCaCl2·2H2O0.04gK2HPO40.5gFeSO4·7H2O0.01gNaNO30.2gEDTA0.08gK2SO41.0gA51mlNaCl1.0gB61mlMgSO4·7H2O0.2g淡水1000ml培養(yǎng)螺旋藻最廣泛使用的配方。③CFTRI培養(yǎng)液（轉(zhuǎn)引自何連金，1988）：NaHCO34.5gMgSO40.2gNaNO31.5gCaCl20.04gK2HPO40.5gFeSO40.01gK2SO41.0gNaCl1.0g淡水1000ml培養(yǎng)螺旋藻使用。④M—Ssl培養(yǎng)液（轉(zhuǎn)引自何連金，1988）：NaHCO34gFeCl3(0.1%溶液)0.2mlNH2CONH20.25gKH2PO40.05g海水1000ml室內(nèi)小水體培養(yǎng)螺旋藻使用。NaHCO32~4gFeCl3(0.1%溶液)0.2mlNH2CONH20.214gKH2PO40.042g海水1000ml室外大面積培養(yǎng)螺旋藻使用。3．微量元素溶液配方（1）A5-B6微量元素溶液[Holm-Hansen,O.,Gerloff,G.C.,Skoog,F.,(1954)]:A5B6H3BO32.86gNH4VO3229.6mgMnCl2·4H2O1.81gCr2k2(SO4)4·24H2O960.2mhgZnSO4·7H2O0.22gNiSO4·6H2O447.8mgCuSO4·5H2O0.08gCo(NO3)2·6H2O493.8mgNa2MoO40.021gNa2WO4·2H2O179.4mg純水1000mlTi溶液20mlH2SO41滴1/20mol/LH2SO41000mlA6-B6微量元素溶液使用很廣泛，A5單獨(dú)使用的例子很多。鈦（Ti）溶液配法：把736.6g草酸鈦，溶解于小量純水中，加入氫氧化銨使成堿性，發(fā)生沉淀。用離心法將沉淀集中，用/20mol/L的硫酸20ml溶解。用量：第1000ml培養(yǎng)液加入A5、B6溶液各1ml。（2）普羅瓦索利的P8微量元素溶液（Provasolietal.,1957）:羥乙基替乙二胺三醋酸CO(Cl)1mg脂鈉3gCu(Cl)2mgFe(Cl)200mgB(H3BO3)200mgZn(Cl)50mgMo(MoO3)50mgMn(Cl)100mg純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入10ml。（3）M—F微量元素溶液[Miller,J.D.A.,Fogg,G.E.,(1957)]:B（H3BO3）0.2gCu(SO4)0.02gMn(Cl2)0.2gZn(SO4)0.02gMo(MoO3)0.2gCo(Cl2)0.02g純水1000mlH2SO4（濃）1滴每1000ml培養(yǎng)液加入1ml。（4）P1微量元素溶液[Pinter,I.J.,Provasoli,L.,(1958)]：EDTA1.0gCo(Cl)0.001gZn(Cl)0.005gCu(Cl)0.00004gMn(Cl)0.04gFe(Cl)0.01g純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入30ml。（5）S—M微量元素溶液[Sorokin,C.;Myers,T.,(1957)]：EDTA50gMoO30.7gB3BO311.4gCuSO4·5H2O1.6gZnSO4·7H2O8.8gCo(NO3)2·6H2O0.5gMnCl2·4H2O1.0g純水1000ml(6)“f/2”ZnSO4·4H2O23mgNa2MoO4·2H2O7.3mgMnCl2·4H2O178mgCoCl2·6H2O12mgCuSO4·5H2O10mgNa2EDTA4.35gFeC6H5O7·5H2O3.9g純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入1ml。（7）艾倫（Allen）的A8微量元素溶液（Allen,M.B.）：Fe0.4gMo（MoO3）0.001gMn(Cl2)0.05gV0.001gZn(SO4)0.005gCo(NO3)0.001gCu(SO4)0.002gN/10H2SO4300mlB(H3BO3)0.05g每1000ml培養(yǎng)液加入3ml。4．維生素溶液配方（1）維生素溶液S3[Provasoli,L.,McLaughlin,J.J.A.,Droop,M.R.,(1957)]：硫胺素鹽酸鹽0.05g肌醇0.5g尼古丁酸（煙酸）0.01g葉酸0.2μg泛酸鈣0.01g胸（腺）間氮苯0.3g對(duì)氨安息香酸1.0g維生素H0.1g純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入1ml。（2）埃弗索爾（Eversole）的維生素溶液[Eversole,R.A.,(1956)]：硫胺素鹽酸鹽100mg鹽酸膽堿200mg維生素B6醇75mg葉酸1mg泛酸鈣200mg維生素H0.05mg雙氨安息香酸5mg肌醇1000mg煙酸胺75mg純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入1ml。（3）“f/2”維生素溶液：維生素B120.5mg維生素H0.5mg維生素B1100mg純水1000ml每1000ml培養(yǎng)液加入1ml。6．硫(S)培養(yǎng)液中硫的來源一般是加入其他營(yíng)養(yǎng)元素的硫酸鹽類(如硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸高鐵、硫酸錳、硫酸銅等)在獲得其他營(yíng)養(yǎng)元素的同時(shí)，也獲得了硫元素。7．鈣(Ca)培養(yǎng)液中鈣的來源，常加入氯化鈣(CaCl2)或硝酸鈣[Ca(N03)2]。8．硅(Si)在硅藻培養(yǎng)液中一般都加入硅元素，硅元素的來源，常用的是硅酸鈉(Na2SO3)和硅酸鉀(K2SiO3)。(二)微量元素微量元素的種類很多，但單胞藻培養(yǎng)液配方中常用的約10余種?，F(xiàn)將其名稱及一般使用的化合物列舉如下：1．硼(B)硼酸(H3BO3)，焦性硼酸鈉(Na2B4O7)。2．錳(Mn)硫酸錳(MnSO4)，氯化錳(MnCl2)。3．鋅(Zn)硫酸鋅(ZnSO4)，氯化鋅(ZnCl2)。4．銅(Cu)硫酸銅((ZuSO4)，氯化銅(CuCl2)。5．鉬(Mo)鉬華(MoO3)，鉬酸銨[(NH4)2O.7MoO3]。6．鈷(Co)氯化鉆(CoCl2)。7．鈦(Ti)氯化鈦(TiCl2)。8．鎢(W)鎢酸鈉(Na2wO4)。9．鉻(Cr)硫酸鉻鉀[CrK(SO4)2]，鉻酸鉀(K2CrO4)。10．鎳(Ni)硫酸鎳(NiSO4)。11．釩(V)釩酸鈉(NaVO3)，釩酸銨(NH4VO3)。12．鎘(CA)氯化鎘(CdCl2)。13．鍶(Sr)硫酸鍶(SrSO4)。這些微量元素可以分開單項(xiàng)列于培養(yǎng)液配方中，也可以把微量元素集中配成微量元素溶液，然后按一定量加入培養(yǎng)液中。這些微量元素溶液有各種配方，一些常用配方將在第69～70頁介紹。藻類對(duì)微量元素的需要量和中毒量(致毒量)的差距一般很狹小，略微超過需要量即會(huì)引起中毒。微量元素也容易形成膠體復(fù)合物和發(fā)生沉淀，使藻類細(xì)胞不能利用。由于以上兩種原因，致使在培養(yǎng)液中保持適量的微量元素是很困難的。絡(luò)合劑的應(yīng)用是解決以上困難的辦法之一。良好的田園土壤抽出液一般含有藻類生長(zhǎng)繁殖所需要的各種微量元素和溶解有機(jī)物質(zhì)，且具有類似絡(luò)合劑的作用。所以在培養(yǎng)液中加入土壤抽出液是解決微量元素供應(yīng)的有效辦法。(三)輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)藻類除了必須吸收無機(jī)營(yíng)養(yǎng)之外，也吸收水中的溶解有機(jī)物質(zhì)，如維生素Bl、維生素B12、生物素……等，這些物質(zhì)對(duì)藻類的生長(zhǎng)有輔助作用，稱為輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)。輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)能促進(jìn)藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，還能增強(qiáng)藻類細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，因此受到重視，加入培養(yǎng)液中的輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)種類也愈來愈多。常用的有維生素B12、維生素B1(硫銨素)、維生素B2、維生素B6、維生素H、生物素、檸檬酸、乳精酸、煙酸，對(duì)氨安息香酸、葉酸、泛酸鈣、肌醇、腐肉堿、胸(腺)間氮苯、葡萄糖、肝抽出物、酵母抽出物、貝肉湯、魚粉、咸魚汁……等。輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)可以分別加入培養(yǎng)液中，也可以把多種輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)配成混合液，稱維生素溶液，在配制培養(yǎng)液時(shí)按一定比例加入。土壤抽出液除含有無機(jī)微量元素外，還含有某些輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)。在培養(yǎng)液中加入土壤抽出液實(shí)際上加入了某些輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)。(四)土壤抽出液土壤抽出液含有單細(xì)胞藻類需要的微量元素和輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)，培養(yǎng)液中加入適量的土壤抽出液，一般能獲得良好效果。土壤抽出液的制作雖然簡(jiǎn)單，但處理方法各有不同?，F(xiàn)將常用的方法介紹如下。1．土壤抽出液I取土壤1kg，加純水1000ml，煮沸60min，在暗處放置2d，過濾，以濾液600ml加純水400ml使用。2．土壤抽出液Ⅱ取土壤1kg，加純水1000ml，再加入氫氧化鈉2～3g，煮沸120min，冷卻后過濾，濾液直接使用。3．土壤抽出液Ⅲ取土壤1kg，加自來水2000ml，煮沸煎濃，把上部泥漿傾入燒杯中澄清，靜置一晝夜后，次日吸取上層清液，再煮沸煎濃。第3天再如法煎煮，最后傾入三角燒瓶中，加棉花塞，煎濃，直至得到l000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸滅菌保存(朱樹屏，1964．)。4．土壤抽出液Ⅳ取田園土壤1kg，加水2000ml，攪拌均勻，浸泡，用前吸取上清液，煮沸消毒后使用(黎尚豪等，1959)。5．海泥(或土壤)抽出液V取海灘上砂質(zhì)較少，有機(jī)質(zhì)較多而又不是過分淤黑的上層軟泥(或田園土壤)，清除其中的小樹枝和小石塊等雜物，以容量計(jì)算1份泥加2份水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置l～2min，待粗砂、小石下沉，把上層泥漿傾人鋁鍋中，棄去底部粗砂、小石等雜物，按每1000ml泥漿加入NaOH1g的量加入NaOH，煮沸20～30min，煮時(shí)需不斷攪拌。煮后靜置24h，吸取上清液使用。海泥抽出液吸出后，除當(dāng)天使用外，可以裝入大燒瓶中再經(jīng)煮沸1～2次(每天1次)，可作較長(zhǎng)時(shí)間的保存，使用時(shí)再經(jīng)煮沸。不同地點(diǎn)取的土壤或海泥制成的土壤抽出液或海泥抽出液的營(yíng)養(yǎng)成分和數(shù)量是不相同的，這是由于不同地點(diǎn)的土壤或海泥所含物質(zhì)的成分和數(shù)量存在著差別的緣故。因此在取用土壤或海泥時(shí)，必須固定地方，不要經(jīng)常變換，對(duì)其培養(yǎng)效果及合適的使用量，均應(yīng)通過培養(yǎng)試驗(yàn)，了解掌握。(五)絡(luò)合劑無機(jī)態(tài)鐵和微量金屬元素容易形成膠體復(fù)合物和發(fā)生沉淀，不能為藻類利用。為了防止這些元素溶膠化和沉淀的發(fā)生，保持其對(duì)藻類的可利用態(tài)，以維持在培養(yǎng)液中的適量存在，哈特納(Hutnei，1950)首先應(yīng)用了稱為絡(luò)合劑的化合物。邁爾(Myers，1951)在培養(yǎng)小球藻中成功地使用了EDTA。其后，在許多培養(yǎng)液配方中，都有絡(luò)合物的使用。最常用的絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)，此外還有亞硝基R鹽、三價(jià)氮基三醋酸(NTA)、羥基乙基乙烯二胺三醋酸(HOEDTA)等。絡(luò)合劑，本質(zhì)上相當(dāng)于環(huán)狀有機(jī)化合物這一類，非常穩(wěn)定，應(yīng)用一定數(shù)量的絡(luò)合劑，可以防止鐵和微量元素的沉淀和溶膠化，并能根據(jù)質(zhì)量作用定律釋放出足量的離子供藻類細(xì)胞利用，能夠大大地減少對(duì)藻類供應(yīng)適量鐵和微量元素的困難，并能使元素的量達(dá)到比藻類所能忍受的較高的濃度。但也有關(guān)于應(yīng)用絡(luò)合劑后，引起某些金屬元素缺乏的報(bào)道(M．R．Droop，1969)。(六)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑又稱植物生長(zhǎng)激素，有促進(jìn)藻類細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的作用。在培養(yǎng)液中加入某些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，增產(chǎn)效果明顯。向曙光等(1986；1989)在亞心形扁藻的培養(yǎng)液中加入30～50mg/L增產(chǎn)靈，凈增產(chǎn)率為60％～70％。又加入40rng／L乙烯利，凈增產(chǎn)率為56％[87]。徐淑鳳等(1987)培養(yǎng)底棲硅藻，在培養(yǎng)液中添加0.5mg／L的-夸乙酸鈉，對(duì)底棲硅藻的生長(zhǎng)繁殖具有明顯的促進(jìn)作用[85]。(七)緩沖劑在培養(yǎng)液中加入緩沖劑，可加強(qiáng)緩沖作用。常用的緩沖劑有三羥甲基氨基甲烷和二甘氨酸。以上介紹了培養(yǎng)液的成分，共七類。但不是說單胞藻培養(yǎng)液都必須具備這七類成分。其中最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)，其他成分只在某些培養(yǎng)液配方中使用其中的一類或兩類。二、培養(yǎng)液配方(一)用純水配制的培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藻類植物的培養(yǎng)研究或其他生理、生化研究時(shí)，必須使用純水配制培養(yǎng)液，并使用純度較高的A．R．級(jí)或C．P．級(jí)化學(xué)試劑。這樣，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)元素的種類和數(shù)量才能比較準(zhǔn)確地在人為控制之下。較理想的純水，是使用離子交換樹脂處理的無離子水，用這種無離子水做微量元素的研究，證明是有效的。通過蒸餾取得的蒸餾水，無論蒸餾器是金屬或玻璃的，在蒸餾水流過蒸餾器時(shí)，可能帶有少量的微量元素。因此，在許多微量元素研究中不宜采用。用純水配制培養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)元素的種類必須全面，使用的化合物也較多。一些科學(xué)工作者還根據(jù)天然海水的化學(xué)成分，在純水中加入無機(jī)化合物配成人工海水，應(yīng)用于海洋生物的研究。(二)用天然淡、海水配制的培養(yǎng)液一般單胞藻餌料培養(yǎng)和以生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)為目的的生產(chǎn)性培養(yǎng)都使用天然淡、海水配制培養(yǎng)液。天然淡、海水是水生生物長(zhǎng)期適應(yīng)于其中生活的優(yōu)良環(huán)境，已存在著植物必須吸收的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在配制培養(yǎng)液時(shí)只需要增加某些在培養(yǎng)中可能引起缺乏的營(yíng)養(yǎng)元素就成了。尤其是大量生產(chǎn)中，往往只加入最主要的幾種營(yíng)養(yǎng)元素，也不必要求采用純度較高的化學(xué)試劑，可使用工業(yè)純和農(nóng)肥。(三)常用單胞藻培養(yǎng)液配方國(guó)外使用的單胞藻培養(yǎng)液配方，數(shù)量眾多。田宮博和渡邊篤(1965)編著的《藻類實(shí)驗(yàn)法》和金尼[KinneO．(1976)]編著的《海洋生態(tài)學(xué)》(MARINEECOLOGY)第三卷，第一部分···…等專著已有較系統(tǒng)的介紹。在此，只重點(diǎn)介紹在國(guó)內(nèi)較常用的培養(yǎng)液配方，也介紹一些國(guó)外配方供參考。1．海產(chǎn)單胞藻培養(yǎng)液配方(1)一般用培養(yǎng)液配方：培養(yǎng)液的配制培養(yǎng)液是根據(jù)培養(yǎng)液配方配制的。為了減少每次稱量的麻煩，固體的營(yíng)養(yǎng)元素一般都配成母液，在使用時(shí)，只要吸取一定的量加入培養(yǎng)液-中即成。主要營(yíng)養(yǎng)元素可以單項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)元素配成母液，也可以分成若干組，每組2種或多種營(yíng)養(yǎng)元素同配在一起。微量元素和輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)也多種組合在一起，配成母液。在濃營(yíng)養(yǎng)溶液中一般生物因不能忍受而死亡。如果配制培養(yǎng)液的海水或淡水是采取常壓加熱消毒的，應(yīng)在消毒后，待冷，在接種前再加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因?yàn)橛行I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(特別是有機(jī)物質(zhì))和海水一起加熱消毒時(shí)，常發(fā)生沉淀。各種(組)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以單獨(dú)消毒，如果營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是潔凈的，在配制時(shí)，只要把容器消毒好，使用蒸餾水或無離子水作溶劑，則可以不用消毒。營(yíng)養(yǎng)元素的加入，應(yīng)該有一定順序。如先加氮，再加磷，后加鐵一…·等。每加入一種(或一組)營(yíng)養(yǎng)物，攪拌均勻，再加第二種。經(jīng)試驗(yàn)和使用過，比較成熟的培養(yǎng)液配方配成的培養(yǎng)液，其RE一般是適合的。但研究和使用新的配方，配好培養(yǎng)液后，應(yīng)測(cè)定RH。如需要，可用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)。天然海水的RH為8.2～8.4，而培養(yǎng)液的RE一般調(diào)節(jié)至7.5左右。第七節(jié)藻種的分離、培養(yǎng)和保藏方法單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)，首先需要有藻種。藻種是從哪里來的呢?原始的藻種是從天然水域混雜的生物群中，運(yùn)用一定的方法，把所需要的藻類個(gè)體分離出來，獲得單種培養(yǎng)的。獲得單種培養(yǎng)的藻種，經(jīng)培養(yǎng)和保藏而長(zhǎng)期保存下來，供培養(yǎng)使用。本節(jié)介紹藻種的分離、培養(yǎng)和保藏方法。一、藻種的分離(一)采樣分離藻種，首先要采集生長(zhǎng)有需要分離的藻類的水樣。個(gè)體較大的浮游藻類，可用密浮游生物網(wǎng)在水中撈取。通過浮游生物網(wǎng)的過濾，可獲得數(shù)量很大的藻類樣品。但在水產(chǎn)動(dòng)物的人工育苗中所需要的餌料藻類，一般是個(gè)體很小的幾m到十幾m的微型藻類，用浮游生物網(wǎng)無法采集到，需要把水樣采回室內(nèi)處理。水樣可取白天然水域，無論是開敞的水面或小港灣都可以采水。但應(yīng)特別注意海岸上存留下來的小水洼，這些小水洼可能只在大潮時(shí)有海水淹沒，有一短段時(shí)間和大海隔絕，鹽度略高于當(dāng)?shù)睾^(qū)海水，尤其在鹽場(chǎng)地區(qū)存在甚多。在這些小水洼中，往往生長(zhǎng)有適于靜水體培養(yǎng)的藻類，且種類比較單純，一種或數(shù)種藻類占優(yōu)勢(shì)，容易分離。還有，培養(yǎng)水生生物的或儲(chǔ)水的各種容器、水池，均可能生長(zhǎng)大量浮游或附著藻類，也是采樣的理想場(chǎng)所。如要分離底棲性微型硅藻，可刮取潮間帶的“油泥"，加海水?dāng)嚢韬?，棄去沉淀的泥砂，用密篩絹濾除大型藻類和雜質(zhì)，即獲得藻細(xì)胞濃度很高的水樣。也可以把附著在大型藻類(如馬尾藻等)藻體上或其他附著物上的附著藻類洗刷下來作為分離的水樣。水樣采回來后，進(jìn)行顯微鏡檢查，如果發(fā)現(xiàn)有需要分離的藻種，而這種藻類在水樣中數(shù)量較多時(shí)，可立即進(jìn)行分離。若數(shù)量很少，分離困難時(shí)，必須先進(jìn)行預(yù)備培養(yǎng)，待其數(shù)量增多后再分離。(二)預(yù)備培養(yǎng)用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各大類藻類應(yīng)該是不同的，一般綠藻、硅藻和金藻的培養(yǎng)液比較現(xiàn)成。對(duì)一些難以培養(yǎng)的藻類，最好加入土壤抽出液。預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)濃度應(yīng)低些，一般只用原配方的1/2、1/3或1/4。如果水樣中藻類的種類較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使各種不同的藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。因此，為了培養(yǎng)好各種藻類，有必要準(zhǔn)備各種適宜的培養(yǎng)液，特別是對(duì)于不容易得到的貴重的樣品，應(yīng)該使用多種預(yù)備培養(yǎng)液培養(yǎng)。預(yù)備培養(yǎng)的容器，通常用3300ml容量的三角燒瓶。在瓶中加入100ml培養(yǎng)液，把經(jīng)密篩絹過濾除去大型生物的水樣50cm3接種進(jìn)去，放在室內(nèi)靠北面的窗口下培養(yǎng)。在分離浮游種類的預(yù)備培養(yǎng)過程中，應(yīng)該每天搖動(dòng)一次培養(yǎng)容器。但在分離附著種類時(shí)，容器可靜止不動(dòng)。因?yàn)樵孱惙N類不同，產(chǎn)生特有的藻群，在培養(yǎng)中往往有單一的藻類集群，這些藻群吸移出來，有可能獲得單種，或雖然達(dá)不到單種，由于混雜的生物數(shù)量少，分離容易。有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。在此情況下，改變培養(yǎng)液的濃度；加入葡萄糖、蛋白胨等有機(jī)物；補(bǔ)充微量元素和輔助生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)；加入土壤抽出液，有可能獲得較好的效果。在預(yù)備培養(yǎng)過程中，要經(jīng)常觀察。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液呈現(xiàn)出淡淡的顏色，即進(jìn)行顯微鏡檢查。如果是需要分離的藻類，數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，應(yīng)立即進(jìn)行分離。如果沒有需要分離的藻類，或者有需要分離的藻類，但數(shù)量不占優(yōu)勢(shì)，分離有困難時(shí)，可再培養(yǎng)一段時(shí)間，等待優(yōu)勢(shì)種發(fā)生交替?；蛘咴俳臃N到不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，有可能在新的培養(yǎng)液中容易形成優(yōu)勢(shì)。總的來說，在預(yù)備培養(yǎng)中，要勤觀察，勤檢查，掌握時(shí)機(jī)，及時(shí)分離。經(jīng)過預(yù)備培養(yǎng)占優(yōu)勢(shì)的種類，分離容易。也適合于在小型靜水體中生長(zhǎng)繁殖。(三)分離方法單細(xì)胞藻類單種的分離方法，常用的有下列3種。1．微吸管分離法選直徑約5ram的細(xì)玻璃管，在酒精噴燈上加熱，待熔，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。微吸管的另一端套接1條長(zhǎng)約30cm(長(zhǎng))或8cm(短)的醫(yī)用乳膠管，在分離操作時(shí)長(zhǎng)乳膠管的另一一一端用牙齒咬緊，如果用短乳膠管則用手指壓緊，用以控制吸取動(dòng)作。將稀釋的水樣，置淺凹載玻片上，在顯微鏡下觀察、挑選要分離的藻細(xì)胞，吸取時(shí)把微吸管口對(duì)準(zhǔn)藻細(xì)胞，牙齒或手指放松，由于氣流的關(guān)系，藻細(xì)胞被微吸管吸入。接著把吸出的水滴放在另一凹玻片上．，顯微鏡檢查這一滴水中是否只有吸出的藻細(xì)胞，無其他生物混雜。如不成，再反復(fù)做，直至達(dá)到單種分離的目的。然后把分離出的藻細(xì)胞移入預(yù)先裝有培養(yǎng)液的試管中，管口塞上棉塞，在適宜的光照條件下培養(yǎng)。每天輕輕搖動(dòng)1次，待培養(yǎng)液呈現(xiàn)出藻色，再經(jīng)顯微鏡檢查，如無其他生物混雜，才達(dá)到分離的目的。微吸管分離法操作技術(shù)難度大，往往吸取1個(gè)細(xì)胞要反復(fù)幾次至十幾次才能成功。而且適宜手分離個(gè)體較大的藻類和其他浮游生物，較小的藻類用此法分離較為困難。2．水滴分離法選直徑約5mm的細(xì)玻璃管，拉制成全長(zhǎng)約8cm的短微吸管5支。另取載玻片30～50塊、試管10-20支、小燒杯2-3只和吸管2支，洗刷清潔后用布抹干，置恒溫烘箱消毒備用。選擇微吸管(無吸管橡皮帽)1支，插入水樣中約2cm，提起微吸管，待無水滴自然滴下，此時(shí)微吸管內(nèi)尚有少量水樣，把微吸管口與載玻片接觸，即有一小滴水樣留在載玻片上。水滴大小以在顯微鏡低倍鏡視野中能看到水滴的全部或大部為準(zhǔn)。如果所選微吸管不理想，另選1支，直到合乎要求為止。把水樣倒入小燒杯中，用培養(yǎng)液稀釋至每一小水滴約有生物1個(gè)左右．(也可能有2個(gè)，也可能1個(gè)沒有)。用微吸管吸取水樣按上述方法滴到載玻片上，一載玻片滴上水滴3～4滴，水滴作直線排列，互相間隔一定距離。然后在顯微鏡下觀察每個(gè)水滴，如果某一水滴內(nèi)只有1個(gè)需要分離的藻類細(xì)胞，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液把水滴連同在水滴中的藻細(xì)胞沖人試管中去，并加入培養(yǎng)液達(dá)到試管容量的1/4，試管口塞上棉花塞，放在適宜的光照條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)試管1次6至試管中的培養(yǎng)液呈現(xiàn)出藻色，經(jīng)顯微鏡檢查是否達(dá)到單種分離的目的。一般分離1種藻類，須同時(shí)分離10支試管，通常在10支試管中總有1-2支試管分離成功，獲得單種培養(yǎng)。水滴分離法在技術(shù)上要求水滴大小符合標(biāo)準(zhǔn)，水樣稀釋適宜、動(dòng)作迅速和觀察準(zhǔn)確。水滴分離法，方法簡(jiǎn)便，易行。尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)的種類。3．平板分離法(1)平板培養(yǎng)基的制備：①調(diào)配：按分離種類的需要，選用合適的無機(jī)肥配方配成培養(yǎng)液，加入1％～1.5％瓊膠(先把瓊膠剪成短段，在淡水中浸泡12h)。②融化：把培養(yǎng)液加熱，不斷攪拌，使瓊膠全部融化。在加熱過程中，水分蒸發(fā)，在加熱完畢時(shí)加入淡水補(bǔ)足因蒸發(fā)損失的水分。③分裝：稍冷后即分裝于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基厚度約0.5cm左右。④滅菌：采用高壓蒸汽滅菌法或間歇蒸汽滅菌法滅菌。平板培養(yǎng)基滅菌后，平放，待冷，培養(yǎng)基凝固成固體狀態(tài)。(2)平板分離方法：平板分離方法有噴霧法和劃線法兩種。①噴霧法：首先用經(jīng)煮沸消毒的海水把水樣稀釋到合適的程度，裝入消毒過的醫(yī)用喉頭噴霧器中，打開培養(yǎng)皿蓋，把水樣噴射在培養(yǎng)基平面上，使水樣在培養(yǎng)基平面上形成分布均勻的一薄層水珠。水樣稀釋到合適的程度是指水樣噴射在培養(yǎng)基平面上必須相隔lcm以上才有1個(gè)生物(或1個(gè)藻類細(xì)胞)，將來生長(zhǎng)繁殖成一藻群后容易分離取出。稀釋不夠，將來生成的藻細(xì)胞群距離太近，不容易分離。②劃線法：水樣不用稀釋，取一金屬接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌后，蘸取水樣輕輕在培養(yǎng)基平面上做第一次平行劃線3～4條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70。角，把接種環(huán)在火焰上滅菌，通過第一次劃線區(qū)做第二次平行劃線。同樣方法通過第二次劃線區(qū)做第三次劃線。再做第四次劃線。由于蘸到接種環(huán)上細(xì)胞較多，在第一劃線區(qū)，藻細(xì)胞群密集分離不開，但在第三、第四劃線區(qū)，可能分離出孤立的藻類群落。噴射或劃線接種后，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，放在適宜的光照條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過20d左右的培養(yǎng)，就可以在培養(yǎng)基平面上生長(zhǎng)出互相隔離的藻類群落。通過顯微鏡檢查，尋找需要分離的藻類群落，然后用消毒過的纖細(xì)解剖針或玻璃微針把藻細(xì)胞群連同一小塊培養(yǎng)基取出，移入裝有培養(yǎng)液的試管或小三角燒瓶中，加棉花塞，在適宜光照的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)中每天輕輕搖動(dòng)1～2次，搖動(dòng)時(shí)避免培養(yǎng)液沾濕棉花塞。經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，藻類生長(zhǎng)繁殖數(shù)量增多，再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無其他生物混雜，才達(dá)到單種培養(yǎng)的目的。如還有其他生物混雜，則再分離，直到獲得單種培養(yǎng)為止。二、藻種的培養(yǎng)獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴(kuò)大培養(yǎng)，供應(yīng)試驗(yàn)和生產(chǎn)使用。另一方面可把藻種作較長(zhǎng)時(shí)間的保藏，需要時(shí)可隨時(shí)取出使用。藻種的培養(yǎng)要求比較嚴(yán)格。常用各種不同大小的三角燒瓶為培養(yǎng)容器，容量有100cm3、300cm3、500cm3、1000cm3等。培養(yǎng)容器、工具經(jīng)恒溫烘箱高溫消毒。培養(yǎng)液用加熱法消毒。接種后瓶口用消毒過的紙包扎。放在適宜的光照條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)兩次。大約2周進(jìn)行1次移養(yǎng)。藻種在培養(yǎng)過程中必須定期進(jìn)行顯微鏡檢查，保持單種培養(yǎng)。三、藻種的保藏單種分離是不容易的，要花費(fèi)不少精力_和時(shí)間。一旦得到了單種，就要設(shè)法把它長(zhǎng)期保存下來。藻種的保藏方法，通常是把藻種接種在固體和液體雙相培養(yǎng)基上，在低溫、弱光條件下培養(yǎng)，接種一次可保藏半年到一年。(一)固體培養(yǎng)基的制備固體培養(yǎng)基(即平板培養(yǎng)基)，作為保藏藻種用的固體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)濃度應(yīng)按配方增加1倍。保種用的容器有試管、三角燒瓶、克氏扁瓶……等，以500cm3容量的三角燒瓶和試管最常用。試管的培養(yǎng)基的分裝量約為試管長(zhǎng)的1/4，三角燒瓶的培養(yǎng)基的分裝厚度約為0.8～1cm。分裝時(shí)應(yīng)防止培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上。分裝后試管口和瓶口須塞上棉花塞，再用紙包扎。培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，取出，試管應(yīng)傾置成斜面，三角燒瓶則平放，待冷，即成固體培養(yǎng)基。(二)接種保藏的藻種，可接種在固體培養(yǎng)基上。把試管的包扎紙和棉塞取下，用滅菌的接種環(huán)蘸取藻液在培養(yǎng)基斜面上作“之"字形劃線接種，再把棉塞塞好，綁緊包扎紙。三角燒瓶和克氏扁瓶可用噴霧法接種，利用醫(yī)用喉頭噴霧器把藻液均勻噴射在培養(yǎng)基平面上。保藏的藻種，也可以在固體培養(yǎng)基上再加上培養(yǎng)液然后接種，稱雙相培養(yǎng)基。此法使用三角燒瓶為容器最理想，在固體培養(yǎng)基上加入比固體培養(yǎng)基體積多2倍的培養(yǎng)液，然后接種少量藻液。利用雙相培養(yǎng)基保藏藻種，可避免固體培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干涸的問題，保藏效果比單用固體培養(yǎng)基好，為通常采用的方法。(三)培養(yǎng)和保藏單用固體培養(yǎng)基保藏的藻種，接種后首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng)，待藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖達(dá)到較高的密度，在平板上可看到藻色明顯的條狀或塊狀的藻細(xì)胞群，再移置低溫、弱光的條件下保藏。雙相培養(yǎng)基保藏的藻種，接種后可直接移置低溫、弱光的條件下保藏，也可在適宜的光照條件下培養(yǎng)3～4d后再移置低溫、弱光的條件下保藏。低溫、弱光的條件，通常是指放在冰箱內(nèi)，溫度控制在5～8℃之間，冰箱內(nèi)裝1支8W的日光管，開關(guān)設(shè)在冰箱外，每天照明l～2h，也可長(zhǎng)期連續(xù)照明。藻種保藏的目的是使藻種能在較長(zhǎng)的時(shí)間保存下來。因此，藻種必須在低溫、弱光的條件下培養(yǎng)，使藻細(xì)胞在培養(yǎng)基上慢慢生長(zhǎng)繁殖，讓培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)慢慢地消耗。在此，應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)，藻種保藏不能沒有光。在弱光的條件下保藏培養(yǎng)，可保存半年到1年，甚至2年以上。但如果不給予光照，保存在完全黑暗的條件下，則保藏時(shí)間大大縮短，且藻細(xì)胞“老化”。

第八節(jié)敵害生物的防治在單細(xì)胞藻類培養(yǎng)過程中，常會(huì)發(fā)生敵害生物污染。污染的敵害生物對(duì)培養(yǎng)藻類的危害是十分嚴(yán)重的，常常使培養(yǎng)歸于失敗。敵害生物的污染和危害是造成當(dāng)前單胞藻培養(yǎng)不穩(wěn)定的主要原因。敵害生物的防治問題，目前還沒有徹底解決。本節(jié)內(nèi)容分?jǐn)澈ι飳?duì)單細(xì)胞藻類的危害作用、敵害生物污染的途徑和防治措施三部分。一、敵害生物對(duì)單細(xì)胞藻類的危害作用(一)掠食一些較大型的敵害生物，如輪蟲(Rotifer)、游仆蟲(Euplotessp.)、尖鼻蟲(Oxyrrhissp.)、變形蟲(Amoebaspp．)等，直接吞食藻細(xì)胞。由于藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度快，如果敵害生物的數(shù)量不多，吞食量不大，影響并不顯著。但當(dāng)敵害生物繁殖數(shù)量多后，吞食量也增大，則對(duì)藻類產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。尤其是輪蟲的吞食量達(dá)到驚人的程度，在二三天內(nèi)可以把藻細(xì)胞吃光，使藻液變清。(二)通過分泌有害物質(zhì)對(duì)單胞藻起抑制和毒害作用敵害生物通過必泌某些有害的胞外產(chǎn)物對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生抑制和毒害作用，是敵害生物對(duì)培養(yǎng)藻類危害的又一方面，它往往比直接吞食的危害程度要嚴(yán)重得多。當(dāng)敵害生物分泌的有害物質(zhì)還較少時(shí)，培養(yǎng)藻類表現(xiàn)為生長(zhǎng)繁殖緩慢。當(dāng)敵害生物繁殖數(shù)量較大，分泌的有害物質(zhì)多時(shí)，即造成藻細(xì)胞大量下沉死亡。敵害生物分泌的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)藻類的毒性大小，依不同種類而異。一種敵害生物對(duì)藻類的危害作用，可能是一方面的，也可能同時(shí)具有兩個(gè)方面的危害作用。二、敵害生物污染的途徑在單細(xì)胞藻類培養(yǎng)生產(chǎn)中，敵害生物可以通過下列途徑污染。(一)水天然水中生活著種類繁多的生物。在單胞藻培養(yǎng)過程中，配制培養(yǎng)液的淡水和海水以及清洗消毒后的容器和工具的用水，如果不經(jīng)過有效的處理或處理不徹底，不能把水中的生物除去或殺死，就會(huì)造成敵害生物的污染。從水這一途徑污染敵害生物，往往污染生物的數(shù)量大，在較短的時(shí)間內(nèi)即能對(duì)培養(yǎng)藻類產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。目前我國(guó)在單胞藻培養(yǎng)生產(chǎn)中，藻種培養(yǎng)與小型培養(yǎng)用加熱法消毒水是有效的。但也不能忽視，如果加熱溫度不夠或持續(xù)時(shí)間不夠，都可能達(dá)不到消毒目的。在大量培養(yǎng)中，水經(jīng)砂過濾后用次氯酸鈉處理或用陶瓷過濾罐作第二次過濾處理都是有效的。但應(yīng)用次氯酸鈉處理水，不測(cè)定次氯酸鈉的有效氯含量以及處理時(shí)間不夠；應(yīng)用陶瓷過濾罐，也可能因?yàn)V棒破裂，安裝不嚴(yán)，拆洗時(shí)棒及罐內(nèi)部沖洗消毒不夠。以上種種原因都可能造成消毒不徹底，而導(dǎo)致敵害生物污染。目前還有一些單位習(xí)慣使用砂濾池過濾水培養(yǎng)單胞藻，砂濾池對(duì)大小在15m以下的微生物無法隔除，生物污染無法避免。(二)空氣微生物通過空氣污染是經(jīng)常發(fā)生的，而且難以避免。開放式培養(yǎng)，藻液和空氣的接觸面大。通氣培養(yǎng)，大量的空氣進(jìn)入藻液中。一些2～3m大小的微生物(其中多數(shù)是單細(xì)胞綠藻類)，可以借風(fēng)力隨塵土在空氣中飛揚(yáng)而污染藻液。目前還沒有防止微生物從空氣污染的有效方法。(三)容器、工具容器和工具消毒不徹底，引起敵害生物污染。(四)肥料肥料不清潔，消毒不干凈，引起敵害生物污染。(五)昆蟲蚊子在培養(yǎng)池中產(chǎn)卵以及水生昆蟲侵入培養(yǎng)池，都會(huì)把敵害生物帶進(jìn)來而引起污染。(六)操作不嚴(yán)工作人員進(jìn)行操作前，手未經(jīng)消毒，操作時(shí)不遵守操作規(guī)程，引起敵害生物污染。三、防治敵害生物的措施對(duì)待敵害生物的污染和危害應(yīng)實(shí)行以防為主、防治結(jié)合的措施，盡可能減少其危害程度。(一)預(yù)防措施1．嚴(yán)格防止污染在單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)過程中，敵害生物污染的可能性是經(jīng)常存在著的。而敵害生物對(duì)培養(yǎng)藻類的危害，又是目前單胞藻餌料培養(yǎng)中存在的最突出的問題，關(guān)系到培養(yǎng)的成敗。因此，培養(yǎng)工作人員應(yīng)充分認(rèn)識(shí)培養(yǎng)工作中這一主要矛盾，加強(qiáng)責(zé)任感，在工作中時(shí)時(shí)、事事、處處嚴(yán)防敵害生物的污染。在培養(yǎng)生產(chǎn)流程中，防止污染的重點(diǎn)應(yīng)該放在生產(chǎn)性藻種培養(yǎng)這一級(jí)上。因?yàn)樵宸N培養(yǎng)在室內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)容器為玻璃瓶，防污染的條件較好。只要藻種級(jí)沒有敵害生物污染，擴(kuò)大培養(yǎng)到水池，生產(chǎn)周期不是很長(zhǎng)，就是發(fā)生污染，敵害生物還需要一段生長(zhǎng)、繁殖的時(shí)間，才能達(dá)到一定的數(shù)量。也就是說，藻種級(jí)“純"，擴(kuò)大培養(yǎng)才有較大的保證。因此，在藻種級(jí)的培養(yǎng)中應(yīng)特別注意嚴(yán)格防止污染。2．保持培養(yǎng)藻類的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)培養(yǎng)藻類生長(zhǎng)情況的好壞和在藻液中數(shù)量是否占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在防止和減輕敵害生物的危害方面，有著重要的作用。長(zhǎng)期的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)說明，當(dāng)培養(yǎng)藻類生長(zhǎng)良好、繁殖迅速時(shí)，敵害生物的嚴(yán)重危害情況較少出現(xiàn)，有時(shí)在受到污染的情況下，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，污染生物的數(shù)量并沒有增加，甚至減少消失。保持培養(yǎng)藻類良好的生長(zhǎng)及其數(shù)量上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，通過分泌較多的胞外產(chǎn)物對(duì)敵害生物起抑制作用是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵所在。保持藻類的良好生長(zhǎng)，首先接種的藻種必須取自指數(shù)生長(zhǎng)期，其次在環(huán)境條件方面盡可能地滿足藻類生長(zhǎng)的要求，使藻類生勢(shì)旺盛。接種的藻種量大，從培養(yǎng)開始培養(yǎng)藻類在培養(yǎng)液中即占有數(shù)量上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。保持培養(yǎng)藻類的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，是減少敵害生物危害的重要措施。3．做好藻種的分離、培養(yǎng)和供應(yīng)工作在培養(yǎng)工作中嚴(yán)格防止污染是重要的，但從目前單細(xì)胞藻類培養(yǎng)的水平來看，在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過程中，絕對(duì)防止敵害生物的污染是不可能的。因此，污染必然或遲或早地發(fā)生，并在適宜條件下，敵害生物大量繁殖，最后導(dǎo)致培養(yǎng)的失敗。要根本解決這個(gè)問題，就必須不斷的補(bǔ)充新的“純"藻種來取代在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中已經(jīng)受污染的藻種，這才有可能使培養(yǎng)較順利進(jìn)行。所以，進(jìn)行藻種的分離、培養(yǎng)和供應(yīng)工作十分重要。(二)清除、抑制或殺滅敵害生物的方法．通常采取清除、抑制或殺滅敵害生物的方法有下列三個(gè)方面。1．使用過濾方法清除大型敵害生物餌料藻類都很小，對(duì)污染的大型敵害生物(如輪蟲……等)，可以用過濾方法清除。通常清除輪蟲可用網(wǎng)孔小于60m的密篩絹過濾，經(jīng)一次過濾可以清除輪蟲的成體，而輪蟲卵和正在發(fā)育的幼小個(gè)體不能完全清除，所以必須連續(xù)過濾3天，每天1次。待第一次過濾后存留下來的卵和幼小個(gè)體發(fā)育成長(zhǎng)為成體后，在第二次或第三次過濾時(shí)清除掉。2．使用藥物抑制或殺滅敵害生物用于抑制或殺滅敵害生物的藥物，有化學(xué)藥品和中草藥兩大類。國(guó)內(nèi)許多單位都進(jìn)行過使用藥物殺滅藻液中敵害生物的試驗(yàn)，但往往由于敵害生物對(duì)藥物的抵抗力比培養(yǎng)藻類強(qiáng)，效果多不理想。因此，到目前為止，有效的藥物方法還不多，有些雖然取得一些初步效果，但還需要進(jìn)一步試驗(yàn)觀察。培養(yǎng)亞心形扁藻和湛江等鞭藻出現(xiàn)尖鼻蟲危害時(shí)，在藻液中加入0.003％的醫(yī)用濃氨水，可有效殺滅尖鼻蟲，不影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖(馬旭升等，未發(fā)表材料)。如果在藻液中細(xì)菌大量繁殖，致使藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、大量下沉，在1L藻液中加入1萬國(guó)際單位青霉素，可有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。3．改變環(huán)境條件殺滅敵害生物使用改變環(huán)境條件殺滅敵害生物的方法，必須了解培養(yǎng)藻類和敵害生物對(duì)生態(tài)因子的適應(yīng)范圍，然后根據(jù)具體情況，“以培養(yǎng)藻類之長(zhǎng)攻敵害生物之短”，改變某一環(huán)境因子達(dá)到殺滅敵害生物而又保存培養(yǎng)藻類的目的。根據(jù)亞心形扁藻能耐高鹽度的特性，使用提高比重的方法殺滅敵害生物。其方法是在被污染的藻液中、加入食鹽，把藻液比重提高到1.056～1.060，游仆蟲等敵害生物可被殺死，對(duì)亞心形扁藻雖有一定的影響，但經(jīng)1～2次稀釋培養(yǎng)，即可恢復(fù)正常生長(zhǎng)(廣東水產(chǎn)研究所海水室，1974)。又，當(dāng)鹽藻培養(yǎng)受到變形蟲危害時(shí)，可以利用鹽藻嗜鹽的特點(diǎn)，在1000cm3藻液中加入食鹽70～110g，不僅能殺死變形蟲，而且能殺死尖鼻蟲、游仆蟲及個(gè)體較小的原生動(dòng)物。一般在加鹽處理后的第15～18d，被污染的鹽藻培養(yǎng)液由黃綠色轉(zhuǎn)為鮮綠色，藻細(xì)胞游動(dòng)活潑，生長(zhǎng)旺盛(徐淑鳳等，1990)。當(dāng)亞心形扁藻、湛江等鞭藻藻液中繁生有尖鼻蟲、游仆蟲、漫游蟲(Lionotussp．)等敵害生物時(shí)，可以采用鹽酸酸化藻液的辦法進(jìn)行殺滅。方法是在1000era3藻液中，加入1mol/L鹽酸溶液3～4cm3，邊加邊充分?jǐn)嚢瑁瑫r(shí)測(cè)定pH，待藻液pH降到3時(shí)，停止加鹽酸溶液，酸化0.5～1h，即可將上列的原生動(dòng)物殺死，然后用1mol／L氫氧化鈉溶液將藻液中和恢復(fù)至原pH范圍。酸化中和后的亞心形扁藻和湛江等鞭藻細(xì)胞經(jīng)23～25h后，就可全部恢復(fù)游動(dòng)，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，藻細(xì)胞能恢復(fù)正常生長(zhǎng)繁殖(劉志芳等，1983)。第九節(jié)幾種比較特殊的培養(yǎng)方法本節(jié)介紹利用天然海區(qū)混雜的各種藻類為藻種的培養(yǎng)、螺旋藻的培養(yǎng)和底棲硅藻的培養(yǎng)等三種比較特殊的培養(yǎng)方法。一、利用天然海區(qū)混雜的各種藻類為藻種的培養(yǎng)(一)同槽培養(yǎng)在對(duì)蝦育苗池施肥培養(yǎng)生物餌料，培養(yǎng)的生物餌料供同池內(nèi)培育的對(duì)蝦幼體食用，生物餌料培養(yǎng)與對(duì)蝦育苗在同一水池內(nèi)同時(shí)進(jìn)行，即同槽培養(yǎng)。同槽培養(yǎng)要求培養(yǎng)池的水容量大，一般選用室外、露天、水容量為200m3的對(duì)蝦育苗池。清池消毒后，把從海區(qū)抽上來，在沉淀池經(jīng)短暫沉淀的海水，通過150目的篩絹網(wǎng)過濾后，灌人池中。用篩絹網(wǎng)過濾的目的是隔除大型的動(dòng)物和雜物，只容許單細(xì)胞藻類和小型浮游動(dòng)物(如原生動(dòng)物、橈足類幼體、浮游幼蟲……等)進(jìn)人池中，以進(jìn)入池水中的種類混雜的單胞藻作為培養(yǎng)的藻種。灌水達(dá)到預(yù)定水位后，施肥培養(yǎng)。灌水后第一天施氮肥2～3mg/L，磷肥0.2~0.3mg/L，以后每天施氮肥0.5～1.5mg/L，磷肥0.05～0.15mg/L。鐵肥和硅肥不必每天施，隔2天或3天施一次或完全不施。鐵肥(FeCl3)的施用量為0.3～0.5mg/L，硅肥(Na2SiO3)為0.05～0.1mg/L。池水施肥后在短時(shí)間內(nèi)便能使水中單細(xì)胞藻類的數(shù)量迅速增加，一般施肥后第三天單胞藻數(shù)量開始急劇上升，第四、五天即可達(dá)到每毫升水體有2～7×104個(gè)細(xì)胞的水平。為了互相密切配合，對(duì)蝦無節(jié)幼體必須在灌水施肥的第二或第三天下池，第四天即有部分無節(jié)幼體發(fā)育到潘狀幼體，這樣就能與池中單胞藻餌料的數(shù)量發(fā)展到能滿足潘狀幼體攝食需要水平相吻合。陳明耀等(1988)對(duì)同槽培養(yǎng)方法進(jìn)行了3年的試驗(yàn)觀測(cè)[73]，在廣東雷州半島，4～6月間，在同槽培養(yǎng)池中出現(xiàn)的單胞藻優(yōu)勢(shì)種主要有下列幾類：1．硅藻類菱形藻(Nitzschiaspp．)、角毛藻(Chaetocerosspp．)、直鏈藻(Melosirasp．)、小環(huán)藻(Cyclotellasp．)。2．綠藻類某些團(tuán)藻目的單細(xì)胞鞭毛藻。3．隱藻類藍(lán)隱藻(Chroomonassp．)。4．甲藻類多甲藻(Peridiniumspp．)、裸甲藻(Cymnodiniumspp．)、薄甲藻(Glenodiniumspp．)。以上優(yōu)勢(shì)種一般在育苗早期，施肥后1周左右的時(shí)間，硅藻類占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，爾后甲藻類逐漸占優(yōu)勢(shì)。提供給溞狀幼體做餌料的主要是硅藻。從其種類組成來看，除長(zhǎng)鏈狀群體的角毛藻和少量較大型的種類(如圓篩藻、盒形藻等)之外，大多數(shù)為5~20um的微型硅藻，適合對(duì)蝦溞狀幼體攝食。在同槽培養(yǎng)池中的餌料生物，除單胞藻外，還有一些動(dòng)物性餌料生物，主要是原生動(dòng)物纖毛蟲類、甲殼動(dòng)物橈足類和一些浮游幼蟲。這些動(dòng)物性餌料生物在培養(yǎng)后期較多。(二)專池培養(yǎng)專池培養(yǎng)與同槽培養(yǎng)不同的是使用專用餌料池培養(yǎng)，施肥量加大，培養(yǎng)時(shí)間短，濃度大。培養(yǎng)池露天，池深80~l00cm，實(shí)際培養(yǎng)水深60cm，池面積30~40m2。水處理方法與同槽培養(yǎng)相同，天然海水經(jīng)短暫沉淀后用150目的篩絹網(wǎng)過濾。灌水達(dá)60cm水深后，一次施硝酸鈉30mg/L、磷酸氫二鉀3mg/L、三氯化鐵O．3mg/L。施肥后，充氣，在露天直射太陽光下培養(yǎng)。夏天光照太強(qiáng)，培養(yǎng)困難，可設(shè)簡(jiǎn)易的空架式池頂，用布蓬部分地遮光。一般培養(yǎng)至第三、四天，水色呈褐色，即可收獲。把藻液用潛水泵抽人對(duì)蝦育苗池使用，一次全部用完。如果不及時(shí)使用，一般一二天內(nèi)藻細(xì)胞大量下沉死亡，水色變清。經(jīng)專池培養(yǎng)，生長(zhǎng)起來的單細(xì)胞藻類，主要為長(zhǎng)鏈的角毛藻，對(duì)蝦溞狀幼體攝食有困難，但其中也有少量適于溞狀幼體攝食的小型硅藻。投喂后，一般蚤狀幼體拖便明顯。專池培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)孰培養(yǎng)速度快，能大量、及時(shí)供餌。缺點(diǎn)是生長(zhǎng)起來的種類絕大部分不適合蚤狀幼體攝食，生長(zhǎng)起來后又極容易大量死亡。螺旋藻的培養(yǎng)(一)開發(fā)的意義螺旋藻的光能轉(zhuǎn)化率高達(dá)18％，光合效率達(dá)43％，而一般農(nóng)作物僅分別為5％～6％和30％[121]。有利于人們充分利用太陽能來生產(chǎn)食品。蛋白質(zhì)含量在50％以上，最高可達(dá)75％。氨基酸種類齊全，特別是必需氨基酸含量較多，其中賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸含量尤其突出，氨基酸平衡達(dá)到聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)蛋白質(zhì)咨詢小組確定的理想的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[132]。真蛋白消化率高達(dá)75％[121]。螺旋藻的脂肪含量較低。纖維素也較少，容易消化。胡蘿卜素、維生素E和維生素C的含量較高。含有較豐富的一般微量元素，還含有微量的硒，這在營(yíng)養(yǎng)上可能有較大的意義[132]。螺旋藻多糖有提高機(jī)體的免疫功能和抑制癌細(xì)胞的作用[124、125]。由于螺旋藻營(yíng)養(yǎng)上具有上述特異優(yōu)點(diǎn)，容易消化和采收方便而深受重視，為世界各國(guó)廣泛研究和開發(fā)的一種新的植物蛋白源。目前，國(guó)外用螺旋藻干粉制成的食品用于治療潰瘍、貧血病、糖尿病、肝炎、肝胖病及視覺不良等疾病，成為運(yùn)動(dòng)員、老年人及傷病員的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健食品。螺旋藻作為餌料生物或囪料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用效果，也已被眾多的試驗(yàn)所證實(shí)。在長(zhǎng)毛對(duì)蝦育苗中用螺旋藻單一投喂，或作為基礎(chǔ)餌料，單位水體出苗量提高5.5％～33.7％[121]。以螺旋藻代替其他單胞藻餌料，兼投輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體進(jìn)行中國(guó)對(duì)蝦育苗，成活率大大提高(張志恒，1988)。又，根據(jù)顧天青試驗(yàn)，培育中國(guó)對(duì)蝦幼體，在ZI～MⅡ階段，以螺旋藻代替豆?jié){加輪蟲，或以螺旋藻加豆?jié){加輪蟲與豆?jié){加輪蟲比較，試驗(yàn)組比對(duì)照組生長(zhǎng)快、成活率高[127]。應(yīng)用螺旋藻培育泥蚶親貝，經(jīng)2周試驗(yàn)，成活率為100％，性腺發(fā)育良好。用這批親蚶進(jìn)行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)率達(dá)98％，受精率95.2％，孵化率92.7％，幼蟲發(fā)育正常。其效果比用地瓜粉或其他單胞藻餌粉好[121]。由于螺旋藻類胡蘿卜素含量高，魚、蝦攝食后，體色格外鮮艷，日本已利用螺旋藻作為錦鯉、c金魚、對(duì)蝦的增色劑。螺旋藻在滿足人類未來需要的許多方面，都具有很大的開發(fā)潛力。(二)培養(yǎng)方法螺旋藻的培養(yǎng)方法與一般單胞藻基本相同，只有下列幾方面有其特殊性。1．培養(yǎng)液的酸堿度目前作為培養(yǎng)對(duì)象的幾種螺旋藻，原生長(zhǎng)在非洲及中南美洲等熱帶地區(qū)強(qiáng)堿性鹽湖中，其繁殖環(huán)境的pH為9.5～11。它們需要較高的堿性培養(yǎng)環(huán)境，它們適應(yīng)的酸堿度范圍為pH8.5～11，最適范圍為pH8.5～9.5。在螺旋藻培養(yǎng)液中必須加入碳酸氫鈉，主要是作為碳源供螺旋藻利用，另一方面它對(duì)培養(yǎng)液的pH起緩沖作用，并能抑制雜藻的污染。在Zarrouk培養(yǎng)液中碳酸氫鈉的加入量為16．8g/L，占總肥料成本的50％以上。林惠民(1991)把Zarrouk培養(yǎng)液碳酸氫鈉的量從16.8g/L減到8.4g/L，把M-Ss培養(yǎng)液碳酸氫鈉的量從8g/L減到4g/L，進(jìn)行比較培養(yǎng)，結(jié)果表明在指數(shù)生長(zhǎng)期差別并不明顯。但他也認(rèn)為碳酸氫鈉加人量低，容易引起敵害生物污染，得不償失[122]。雖然培養(yǎng)液中加入了碳酸氫鈉，對(duì)pH有緩沖作用，但在培養(yǎng)過程中，由于二氧化碳的不斷被利用，pH也不斷上升，有可能超出適應(yīng)范圍，輕則影響藻體生長(zhǎng)，藻色變黃。重則絲狀體解體，最終培養(yǎng)失敗。所以在培養(yǎng)過程中必須注意觀測(cè)藻液pH的變化，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，這是十分重要的。用海水培養(yǎng)，由于海水自身就是一種良好的緩沖液，pH的升高及對(duì)藻體的影響沒有用淡水培養(yǎng)那樣突出。吳伯堂(1992)使用南海Ⅱ號(hào)培養(yǎng)液(配方未發(fā)表)進(jìn)行鈍頂螺旋藻SCS品系海水半連續(xù)培養(yǎng)，pH始終保持在10.0左右，最多不會(huì)超過10.5[13l]。也可以在藻液中通人CO2含量為2.5％的混合空氣，在培養(yǎng)102h內(nèi)pH由8.6上升到9.2，而后在96h內(nèi)pH無變化，相當(dāng)穩(wěn)定[122]。2．海水馴化螺旋藻原生活在堿性水體中，可以在淡水中培養(yǎng)，也可以通過逐步馴化適應(yīng)在海水中生長(zhǎng)。吳伯堂等(1988)對(duì)鈍頂螺旋藻進(jìn)行海水馴化的步驟是：①將原藻種接種在最低一級(jí)濃度的氯化鈉(分析純)配制的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)一段時(shí)間后通過顯微操作挑選正常螺旋藻絲狀體再接種到氯化鈉較高的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以此類推，直到氯化鈉的濃度達(dá)3.5％。②經(jīng)過氯化鈉培養(yǎng)液逐步馴化獲得的正常絲狀體，用海鹽(食用粗鹽)配制的培養(yǎng)液再作進(jìn)一步馴化，順序過程同上。③將上述經(jīng)海鹽馴化過的螺旋藻，以上述同樣的順序過程和方法以自然海水培養(yǎng)，直到海水鹽度達(dá)3.5％，螺旋藻仍能正常生長(zhǎng)，不再產(chǎn)生任何程度的凝聚現(xiàn)象，馴化即獲成功。經(jīng)馴化的螺旋藻在海水中生長(zhǎng)要比在淡水中生長(zhǎng)快，而且蛋白質(zhì)含量也較高[123]。此外，由于海水中含有較大量的鎂、鈣元素和各種微量元素，海水培養(yǎng)螺旋藻的培養(yǎng)液配方可大大簡(jiǎn)化，所需碳源(NaHCO3)和氮源的量也比淡水配方少，因而生產(chǎn)成本比用淡水培養(yǎng)低[131]。3．培養(yǎng)目前人工培養(yǎng)的幾種螺旋藻原生活在熱帶地區(qū)，對(duì)高溫、強(qiáng)光的適應(yīng)性強(qiáng)，而且在適宜的高溫、強(qiáng)光下，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，我國(guó)的南方，特別是海南島是培養(yǎng)螺旋藻理想的地方。雖然螺旋藻適應(yīng)強(qiáng)光，但它們對(duì)光也是十分敏感的，一般來說，試管斜面藻種在2000～30001x、室內(nèi)玻璃容器培養(yǎng)在3000~50001x、大面積培養(yǎng)在10000～300001x的光照強(qiáng)度以內(nèi)，生長(zhǎng)良好。但當(dāng)接種后藻體濃度較稀時(shí)，強(qiáng)光極易使絲狀體受傷，葉綠素分解，藻色變黃，甚至死亡。因此，在培養(yǎng)初期，、以較弱的光照為宜，必須有遮光設(shè)施。接種時(shí)間宜在傍晚進(jìn)行，接種后應(yīng)遮光2～3天，以后隨著生長(zhǎng)，藻絲密度增加而逐步提高光照強(qiáng)度。在培養(yǎng)過程中，當(dāng)光照太強(qiáng)時(shí)，要遮光、增加攪拌次數(shù)或間歇性充氣。如短期內(nèi)受到強(qiáng)光的傷害，可將受害的藻體移至弱光處，1～2d內(nèi)可恢復(fù)正常[121]。配制螺旋藻培養(yǎng)液的氮源，以尿素的效果最好，硝酸鹽次之。銨態(tài)氮對(duì)螺旋藻的毒害作用很大，超過30mg／L就會(huì)傷害藻體，因此，不宜使用硝酸銨或硫酸銨為氮源[121]。螺旋藻的保種培養(yǎng)有固體和液體兩種方法。試管斜面瓊脂培養(yǎng)，接種后置于室內(nèi)散射光環(huán)境中培養(yǎng)，每隔30～60d重新接種1次。液體保種用三角燒瓶，接種后在散射光下培養(yǎng)，每天搖動(dòng)2~4次，每隔30～40d換1次新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。螺旋藻的生產(chǎn)流程，一般分藻種瓊脂培養(yǎng)、三角燒瓶培養(yǎng)(以上屬藻種培養(yǎng))、玻璃缸培養(yǎng)、室內(nèi)瓷磚池培養(yǎng)(以上屬中繼培養(yǎng))、室外水泥池培養(yǎng)(生產(chǎn)性大量培養(yǎng))5級(jí)。每支試管斜面瓊脂藻種可接種2000ml左右的培養(yǎng)液，經(jīng)10～15d培養(yǎng)可達(dá)到再擴(kuò)大培養(yǎng)的密度。采用液體藻種接種時(shí)，藻種藻液量與新培養(yǎng)液量之比，玻璃容器培養(yǎng)以1:5、池養(yǎng)以1:10～20為宜。大面積池養(yǎng)，由于藻體通常升浮在水面，培養(yǎng)池的深度通常為40～50cm，實(shí)際培養(yǎng)水深一般為25～30cm[121]。但吳伯堂等(1992)報(bào)道，從1989年6月6日到12月30日培養(yǎng)螺旋藻，平均培養(yǎng)水深為18．0cm，平均單產(chǎn)為6.6g/m2·d-1。又從1990年3月12日到6月15日培養(yǎng)螺旋藻，平均培養(yǎng)水深為13.2cm，平均單產(chǎn)為12.01g/m2·d-1，最高單產(chǎn)為14.9g/m2·d-1。此結(jié)果表明，在10～15cm的水深條件下培養(yǎng)，產(chǎn)量比在15～22cm的水深條件下培養(yǎng)高出將近一倍。究竟最佳的培養(yǎng)水深范圍是多少?還有待進(jìn)一步探討。在研究這一問題時(shí)，應(yīng)聯(lián)系水溫、光照度、充氣等方面的條件去考慮。(三)采收和加工1．采收螺旋藻的產(chǎn)量以每天每平方米產(chǎn)干粉多少克來表示。國(guó)外產(chǎn)量為8～15g/m2·d-1，國(guó)內(nèi)產(chǎn)量目前還較低，一般為7～12g/m2·d-1。當(dāng)藻液呈墨綠色時(shí)即可收獲。螺旋藻的生理活動(dòng)有日周期性變化，使藻細(xì)胞的化學(xué)成分亦發(fā)生相應(yīng)的變化。藻細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量在早晨最高，在傍晚則很低[121]。如果培養(yǎng)目的是生產(chǎn)蛋白質(zhì)，那么，采收工作應(yīng)在清晨完成。把螺旋藻培養(yǎng)池的藻液濃集起來的采收方法有多種，一般作為生物餌料培養(yǎng)，規(guī)模不是很大的，可用重力過濾法采收，簡(jiǎn)單、方便。最常用的是用200～300目(目為非法定計(jì)量單位，下同)篩絹布或白色的確涼布做成寬約40em、長(zhǎng)約80em(或其他規(guī)格)的袋子，取1條口徑為3．3cm(1寸)的水管把池中藻液虹吸出來，水管的排水口一端伸入袋內(nèi)用繩子從袋口處綁緊。也可用小型潛水泵把池中藻液抽入袋中。利用重力和一定的壓力作用，濾去水分，可獲很濃厚的藻泥。也可用花籃式的塑料盆或桶(或用一般的塑料盆、桶鉆孔加工而成)，在盆(桶)上鋪一塊篩絹或的確涼布，用水瓢取培養(yǎng)池上浮的藻體放盆中過濾。如果采收的數(shù)量較多，可用鋼筋焊成漏斗狀架子，架子上輔一層篩絹或的確涼布，把藻液置于其上過濾。如果是育苗場(chǎng)培養(yǎng)螺旋藻用作餌料使用的，則根據(jù)需要在投餌前過濾，直接用過濾后的藻泥投喂