環(huán)境生物技術污染物的生物毒性監(jiān)測與評價研究方法司演示文稿

環(huán)境生物技術污染物的生物毒性監(jiān)測與評價研究方法司演示文稿現在是1頁\一共有63頁\編輯于星期四（優(yōu)選）環(huán)境生物技術污染物的生物毒性監(jiān)測與評價研究方法司現在是2頁\一共有63頁\編輯于星期四5.6.1生物測試及方式（1）生物測試（Bioassay）的概念：指系統(tǒng)地利用生物的反應測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時所導致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應包括分子、細胞、組織、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應注釋2：生物測試與物理化學測試的比較現在是3頁\一共有63頁\編輯于星期四注釋2：生物測試與物理化學測試的不同之處？生物測試不同于常規(guī)的物理、化學檢測。前者能夠測定污染物對生物機體的影響，而后者只能測定污染物的濃度。例如：通過水污染的生物測試可獲得以下數據：各種環(huán)境因素如DO、pH、溫度、混濁度等對生命的有利以及不利的濃度或強度；污染物對受測生物的毒性；各種水生生物對污染物的相對敏感性；廢水所應處理的程度；允許的污染物排放濃度等?，F在是4頁\一共有63頁\編輯于星期四（2）生物測試的方式根據生物測試所經歷的時間長短：短期生物測試/中期生物測試/長期生物測試根據試驗溶液或試驗氣體的給予方式：靜止式生物測試/流動式生物測試根據生物測試中所用測試生物的物種：單物種生物測試、多物種生物測試和模擬生態(tài)系統(tǒng)生物測試根據生物測試中所測試的生物效應性質：毒性試驗、積累試驗、行為試驗、“三致”（致癌、致畸、致突變）試驗、損傷試驗等等。。。。。?！，F在是5頁\一共有63頁\編輯于星期四短期生物測試（ShortTermBioassays）被試生物在短時間內暴露于高濃度的污染物下，測定污染物對生物機體的影響。主要用于測定LC50、IC50、EC50用來快速估計污染物的毒性；評定幾種不同毒物或廢物對某種生物的相對毒性；指示出中期或長期試驗所應使用的毒物濃度。多數采用靜止式。中期生物測試（IntermediateTermBioassays）時間為8d到90d，多數情況下為流動式?，F在是6頁\一共有63頁\編輯于星期四長期生物測試（LongTermBioassays）包括全部生活史的生物測試（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物測試（PartialLife－cycleBioassays）目的是要測定出在持續(xù)情況下不造成有害效應的毒物最大濃度或最大允許毒物濃度（MATC）只能采用流動式現在是7頁\一共有63頁\編輯于星期四受試生物的選擇敏感性廣泛性和可獲得性有代表性，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成易于實驗室培養(yǎng)和繁殖具有豐富的生物背景資料對毒物的響應能夠被反應和測定等等現在是8頁\一共有63頁\編輯于星期四影響生物測試結果的因素受試生物試驗條件：要保證試驗的環(huán)境條件（pH、硬度、溫度等）和自然界的季節(jié)變化相符合。不同實驗室：人員操作水平、儀器設備差異生物測試的標準化現在是9頁\一共有63頁\編輯于星期四（1）生物毒性的基本概念毒物（Toxicant）一定條件下，可引起不良生物反應的外來化學物質。毒物與非毒物之間不存在絕對的界限，通常一種物質只有達到中毒劑量時才是毒物。中毒（Intoxication）生物體受到毒物作用引起功能或器質性改變后出現的疾病狀態(tài)。中毒是各種毒性作用的綜合表現，包括急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒。5.6.2一般毒性試驗現在是10頁\一共有63頁\編輯于星期四毒性（Toxicity）指一種物質引起機體損傷的能力。毒性作用或毒效應（ToxicEffect）化學物引起生物體損害的總稱無損害作用（Non-adverseEffect）可逆的生物學變化，不引起機體形態(tài)、生長發(fā)育和壽命的改變；不引起機體功能容量的降低和對額外應激狀態(tài)代償能力的損害等?，F在是11頁\一共有63頁\編輯于星期四

效應（Effect）也稱為作用，指接觸一定劑量化學物后，使機體產生的生物學改變。效應是對個體而言的，這種改變可用一定的計量單位表示。反應（Response）指接觸一定劑量化學物后，產生某種效應并達到一定強度的個體在群體中所占的比例。反應是對群體而言的，用百分率或比值來表示，如發(fā)病率、死亡率等?，F在是12頁\一共有63頁\編輯于星期四劑量－效應關系（Dose-effectRelationship）劑量－反應關系（Dose-responseRelationship）分別表示不同劑量在個體或群體中表現出來的量效應大小之間的關系，以及不同劑量與質效應發(fā)生率之間的關系。以劑量為橫坐標，以表示效應強度的計算單位或表示反應的百分率或比值為縱坐標繪制散點圖所得到的曲線，即為劑量－效應關系和劑量－反應關系曲線。不同的化學物或同一化學物在不同條件下，其劑量與效應或反應的相關關系不同，可呈現不同類型的曲線。（見圖3－1，3－2，3－3，3－4）現在是13頁\一共有63頁\編輯于星期四劑量－效應關系和劑量－反應關系曲線圖劑量10050反應強度（％）圖3－1劑量－反應曲線（直線型）劑量10050死亡率（％）圖3－2劑量－反應曲線（拋物線型）對數劑量10050死亡率（％）圖3－3劑量－反應曲線（S形線型）死亡率（概率單位）對數劑量10050圖3－4劑量－反應曲線現在是14頁\一共有63頁\編輯于星期四危害性（Hazard）:有毒物質在與機體接觸或使用過程中，引起中毒的可能性。與風險（Risk）相近危險性：化學物質在正常的生產使用條件下，能引起機體發(fā)生中毒的可能性。偏重物質本身性質?，F在是15頁\一共有63頁\編輯于星期四（2）毒性試驗常用參數致死劑量或致死濃度（LethalDose/LD，LethalConcentration/LC）表示一次染毒后，在一定時間內引起受試動物死亡的劑量或濃度。絕對致死劑量或濃度（LD100、LC100）半數致死劑量或濃度（LD50、LC50）最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）現在是16頁\一共有63頁\編輯于星期四最大無作用劑量（MaximumNo-EffectLevel,MNEL）指化學物在一定時間內，按一定方式與機體接觸，按一定的檢測方法或觀察指標，不能觀察到任何損害作用的最高劑量。隨實驗方法的改進而變化每日容許攝入量（AcceptableDailyIntake，ADI）最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration，MAC）最小有作用劑量（MEL）/中毒閾劑量（TL）現在是17頁\一共有63頁\編輯于星期四毒作用帶（ToxicEffectZone）一種根據毒性和毒性作用特點綜合評價外來物危險性的指標。是對LD50的補充。急性毒性作用帶（Acute－toxicEffectZone）慢性毒性作用帶（Chronic－toxicEffectZone）現在是18頁\一共有63頁\編輯于星期四半效應濃度（EC50）在一定時間內，引起50%受試生物的某種效應變化的濃度。只有同種效應才能比較。半數抑制濃度（IC50）是指能引起受試受試生物50%抑制的濃度常用于對生長速率和活性的抑制?，F在是19頁\一共有63頁\編輯于星期四毒物單位與分級：mg/L,mg/kg,mg/m3分級：按急性毒性，人為分級。與染毒方式有關?，F在是20頁\一共有63頁\編輯于星期四現在是21頁\一共有63頁\編輯于星期四（3）急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）研究化學物質大劑量一次染毒或24小時內多次染毒動物所引起的毒性的試驗。其目的是短期內了解該物質的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設計依據。急性毒性試驗類型哺乳動物急性毒性試驗水生生物急性毒性試驗蚯蚓急性毒性試驗現在是22頁\一共有63頁\編輯于星期四急性毒性試驗過程（嚙齒類）（1）按試驗要求選擇受試生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄動物同時試驗，對試驗動物預先觀察幾天后標記編號并隨機分組。（2）預備試驗和確定劑量組選用少量動物進行預備試驗，求出引起動物90％（或全部）死亡的劑量（即最高劑量組劑量）和引起動物10％死亡（或不死亡）的劑量（即最低劑量組劑量）。在最高劑量組劑量和最低劑量組劑量的范圍內，按等比級數插入若干個中間劑量（一般為4-6個），從而確定正式試驗的劑量組?，F在是23頁\一共有63頁\編輯于星期四（3）染毒方式和受試物的配制一般用灌胃法和人工熏氣法。受試物的配制：配制試驗所需的最高劑量濃度溶液，然后依次稀釋到所需濃度。（4）觀察指標中毒癥狀：一般觀察24～48小時，最好觀察到絕大多數動物出現典型中毒癥狀。動物死亡數目和死亡時間病理檢查：對于試驗時立即死亡的動物，可解剖，分析死亡原因，看是技術事故還是中毒引起的死亡?，F在是24頁\一共有63頁\編輯于星期四（5）確定半數致死量（LD50）（6）試驗結果LD50值越小，毒性越大。急性毒性試驗結果只能粗略地表示某化學物質的毒性，而不能全面反映其毒性。由于動物種屬、性別、染毒方式的不同，所表現的毒性也不一致，故表示LD50應注釋明動物種類和染毒方式?，F在是25頁\一共有63頁\編輯于星期四魚類急性毒性試驗過程選擇合適的魚類確定養(yǎng)殖條件水質、水量、pH、溫度、溶氧量等蚯蚓急性毒性試驗過程主要評價土壤中殘留農藥的毒性一般采用試紙法（蚯蚓與浸潤在試紙上的有害物接觸）與人工土壤法（將一定濃度的有害物置于人工土壤中）現在是26頁\一共有63頁\編輯于星期四（4）亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗亞慢性毒性試驗在生物生命周期的1/20~1/30時間內,使生物每天或反復多次接觸受試物的毒性實驗，以確定最大毒物效應劑量和效應時間。采用的劑量是LD50的1/80~1/50，給藥途徑盡量模仿人類在環(huán)境中實際的接觸方法。觀察的指標主要有：（a）表觀指標，如生長情況、活動能力、死亡等（b）血液與生化指標，如血細胞、肝功能等（c）病理組織學檢查，如肝、肺腎等有否病變等現在是27頁\一共有63頁\編輯于星期四現在是28頁\一共有63頁\編輯于星期四慢性試驗目的是最終確定最大無作用劑量，為制定人體每日允許攝入量和最高容許濃度提供毒理學依據。實驗步驟如下：選擇與確定實驗動物；實驗濃度為亞慢性實驗中最低中毒濃度的1/10~1/50;給藥方法同亞慢性，試驗周期約數個月至兩年（基本覆蓋受試動物整個生命周期）；觀察指標同亞慢性?，F在是29頁\一共有63頁\編輯于星期四（5）蓄積毒性試驗低于中毒閾劑量的外來化合物，反復多次地與機體持續(xù)接觸，經一定時間后使機體出現明顯的中毒表現，即為蓄積毒性作用是由于外來化合物進入機體的速度大于有機體消除的速度，而使外來化合物在體內的量不斷累積，達到了使機體引起毒性作用的閾劑量所致。是引起亞慢性和慢性毒性作用的基礎。是評估環(huán)境污染毒性作用的常用指標之一，也是制訂其在環(huán)境中的衛(wèi)生標準的重要參考依據?，F在是30頁\一共有63頁\編輯于星期四蓄積系數法（CumulativeCoefficientMethod）是分次給受試物后引起50%受試動物出現某種毒效應的總劑量，與一次給受試物后引起50%受試動物出現同一毒效應的劑量的比值

蓄積系數K＝（比值愈小，表示蓄積作用愈強）現在是31頁\一共有63頁\編輯于星期四現在是32頁\一共有63頁\編輯于星期四生物半減期生物半減期（T1/2）是指一種外來化合物在體內消除到原有濃度（或量）的一半所需要的時間。生物半減期越長的物質，表示越不易由體內消除，其蓄積作用的可能性就越大。T1/2=現在是33頁\一共有63頁\編輯于星期四動物細胞模型法采用動物細胞（如：非洲綠猴腎細胞）作為試驗受體，通過細胞培養(yǎng)，觀察含外源化學物質的培養(yǎng)基中細胞的生長情況（與對照相比較），從而確定化學物對細胞生長產生毒效應；測試時間一般只需48h，而且重復性好、成本低、可較直接反應對人體的影響。細胞水平檢測：5.6.3生物的分子和細胞水平檢測現在是34頁\一共有63頁\編輯于星期四分子水平檢測1：加合物的測定DNA－加合物的測定

蛋白加合物的測定eg：Hb—加合物現在是35頁\一共有63頁\編輯于星期四分子水平檢測2：酶活性的測定方法：直接法：指直接測定體液中酶的含量，該法技術要求較高；間接法：通過測定酶反應中底物的減少或產物的增加量來確定酶的活性，該方法目前使用廣泛，但要求反應專一性較高，反應結果與過程方便觀察?，F在是36頁\一共有63頁\編輯于星期四酶活性的測定一般代謝酶的活性測定乙酰膽堿酯酶腺三磷酶解毒系統(tǒng)酶類誘導作用的檢測混合功能氧化酶的誘導作用谷胱甘肽硫轉移酶抗氧化防御系統(tǒng)檢測過氧化氫酶谷胱甘肽過氧化酶現在是37頁\一共有63頁\編輯于星期四基本概念突變（Mutation）：生物體的遺傳物質發(fā)生了基因結構的變化?；蛲蛔儯℅eneMutation）和染色體畸變（ChromosomeMutation）基因突變：只涉及染色體的某一部分的改變，不能用光學顯微鏡直接觀察染色體畸變：染色體的數目或結構發(fā)生改變，可用光學直接觀察（1）致突變試驗5.6.4生物致突變、致畸和致癌效應檢測現在是38頁\一共有63頁\編輯于星期四致突變作用（Mutagenesis）和致突變物（Mutagen）致突變作用：某些物質引起生物體的遺傳物質發(fā)生基因結構改變的作用致突變物：具有引起生物體的遺傳物質發(fā)生基因結構變化的物質現在是39頁\一共有63頁\編輯于星期四致突變試驗的目的確定某種外來化合物（或環(huán)境污染物）對生物體是否具有致突變作用。致突變試驗方法基因突變試驗例如Ames試驗、哺乳動物體細胞突變株試驗染色體畸變試驗DNA損傷試驗現在是40頁\一共有63頁\編輯于星期四Ames試驗（沙門氏菌回復突變試驗）Ames試驗原理利用一種營養(yǎng)缺陷型突變型菌株與受試物接觸，若此化學物質具有致突變性，可使突變型微生物再發(fā)生回復突變，重新成為野生型微生物。注釋1：營養(yǎng)缺陷型突變型菌株：不具合成組氨酸的能力，不能在低營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長注釋2：野生型微生物：現在是41頁\一共有63頁\編輯于星期四鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗法某些化學物質需經代謝活化才有致變作用，在測試系統(tǒng)中加入哺乳動物微粒體酶，從而彌補體外試驗缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。方法：在動物體外將待測物經肝微粒體酶系活化后，檢測其所誘發(fā)的沙門氏菌回變菌落數。突變率＝誘發(fā)回復突變菌落數/自發(fā)回復突變的菌落數（對照）當突變率大于2.0時，為陽性結果?，F在是42頁\一共有63頁\編輯于星期四Ames試驗的應用檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性，由此推測其致癌性；檢測水源水和飲用水的致突變性，探索較現行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施；檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結合化學分析，追蹤污染源，為研究防治對策提供依據；檢測土壤、污泥、工業(yè)廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性，以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，通過農作物危害人類；檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經由大氣，通過呼吸對人體發(fā)生潛在危害；研究化合物結構與致變性的關系，為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供理論依據；還有用Ames試驗篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗癌藥。。。。?！，F在是43頁\一共有63頁\編輯于星期四原理：某種動物體細胞突變株缺乏利用嘌呤堿的酶，因此不能利用某些嘌呤堿類似物，但正常細胞可以利用。當培養(yǎng)液中存在有一些不常見的嘌呤堿類似物時，正常細胞可以將這些嘌呤類似物結合進DNA中，從而影響細胞生長。但突變型細胞不受影響。一旦突變型細胞和某種化學物接觸后又變?yōu)閷@些嘌呤堿敏感的野生型，就說明這種化學物具有致突變性哺乳動物體細胞突變株試驗現在是44頁\一共有63頁\編輯于星期四體外培養(yǎng)法：動物細胞（如淋巴細胞等）在一定的培養(yǎng)液中37oC培養(yǎng)1－3天，培養(yǎng)過程中與受試物同步接觸。在細胞收獲前加入秋水仙堿使細胞分裂停止于分裂中期（該期的細胞較易觀察胞內的染色體結構），然后經一定的預處理，在顯微鏡下觀察染色體數目和結構等（如斷裂、缺失、環(huán)狀等）。體內試驗法：也采用灌胃或腹腔注射方式使受試物進入動物體內（如小鼠等），飼養(yǎng)數個月，在處死前注入秋水仙堿，抽取骨髓細胞經預處理后顯微觀察。顯微鏡檢測染色體畸變現在是45頁\一共有63頁\編輯于星期四

微核是染色單體或染色體的無著絲點斷片或因紡錘體受傷而失去的整個染色體，在分裂后期，仍留在細胞質中，或因核膜受損后核物質向外突出延伸形成，形成一個或幾個規(guī)則的圓形或橢圓形小體，其嗜染性與細胞核相似，比主核小，故稱微核。蠶豆根尖微核實驗微核實驗現在是46頁\一共有63頁\編輯于星期四現在是47頁\一共有63頁\編輯于星期四概念畸形（Malformation）、畸胎（Terate）畸形：胚胎在發(fā)育過程中，由于受到某種因素的影響，使胚胎的細胞分化和器官形成不能正常進行，而造成器官組織上的缺陷，并出現肉眼可見的形態(tài)結構異?；ィ河谢蔚呐咛セ蛱プ蟹Q為畸胎（廣義的畸胎還包括生化、生理功能及行為的發(fā)育缺陷）致畸作用（Teratogenesis）、致畸物（Teratogen）致畸物通過母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現象稱為致畸作用。（2）

致畸效應現在是48頁\一共有63頁\編輯于星期四“反應?！敝禄F在是49頁\一共有63頁\編輯于星期四致畸作用的毒理學特點不同發(fā)育階段敏感性不同不同發(fā)育階段畸形不同種屬差異明顯致畸作用帶較窄現在是50頁\一共有63頁\編輯于星期四化學致畸作用機理突變引起胚胎發(fā)育異常；對細胞的生長分化較為重要的酶類受到抑制；母體正常代謝過程被破壞；細胞分裂過程的障礙現在是51頁\一共有63頁\編輯于星期四致畸試驗目的：檢測環(huán)境污染物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形。一般過程為選擇合適的受試動物，受孕后給予一定劑量的化學物（如灌胃等），在自然預產期前1－2天解剖檢查胎兒是否發(fā)生畸形。一般試驗動物要求其對化學物質的代謝過程與人相似，胎盤結構也相似，還要求孕期短，產仔多，經濟實用，如大鼠、家兔、小鼠等?，F在是52頁\一共有63頁\編輯于星期四致畸作用的評價注意與自然變異區(qū)分；注意種屬差異；注意試驗的閾劑量與人類實際可能攝入量之間的差別?，F在是53頁\一共有63頁\編輯于星期四概念癌：細胞自主生長，不斷分裂形成危害機體的腫塊（惡性腫瘤）?；瘜W致癌作用（ChemicalCarcinogenesis）指化學物質（包括有機、無機、天然和合成的化學物質）引起腫瘤的過程。化學致癌物（ChemicalCarcinogen）指能誘發(fā)腫瘤的化學物質。致癌因素：化學物理：射線生物：病毒（3）致癌效應現在是54頁\一共有63頁\編輯于星期四細胞癌變學說體細胞突變學說癌變形成的基礎是體細胞發(fā)生了突變，導致其功能發(fā)生異常。分化障礙學說細胞癌變不一定需要體細胞遺傳物質發(fā)生突變，而只是細胞分化過程中有關的基因調控過程受到致癌因素的干擾，使細胞分化和增殖發(fā)生紊亂而出現癌變。現在是55頁\一共有63頁\編輯于星期四癌變過程引發(fā)階段正常細胞轉化為癌細胞的過程。促長階段促長是經過引發(fā)的癌細胞不斷增殖直至形成一個臨床上可被檢出之腫塊的過程，是癌的增殖階段。促進過程需要較長的時間，一般為可逆過程。浸潤和轉移階段浸潤：癌細胞分泌毒素，侵蝕和破壞體內各種組織和器官。轉移：癌細胞從初生腫瘤中離散，隨血液循環(huán)向全身擴散?，F在是56頁\一共有63頁\編輯于星期四致癌試驗目的：檢驗受試物及其代謝產物是否具有致癌效應或誘發(fā)腫瘤作用的慢性毒性試驗法。