微生物原生質體融合育種課件

微生物原生質體融合育種姓名：付鳳根一、概述原生質體融合(protoplastfusion)是20世紀70年代發(fā)展起來的基因重組技術。原生質體：細胞內由原生質組成的各種結構統稱為原生質體,包括細胞膜、細胞質(包括各種細胞器、細胞骨架系統及胞基質)和細胞核等部分,原生質體是由原生質特化而來。植物細胞即細胞壁內的原生質部分;動物細胞就是原生質體。原生質體融合：利用物理、化學或生物學方法，誘導遺傳特性不同的兩個親本原生質體融合，經染色體交換、重組而達到雜交的目的，經篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。HerecomesyourfooterPage2大幅提高親本間的重組頻率擴大重組的親本范圍原生質體融合時親本整套染色體參與交換、遺傳物質轉移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀機會更大。與常規(guī)雜交相比，原生質體融合具有的優(yōu)勢：不足之處：原生質體融合后DNA交換和重組隨機發(fā)生，增加重組體分離篩選的難度。HerecomesyourfooterPage3根據融合的目的選擇適宜的直接親本?，F在一般認為親本應采用具有較大遺傳差異的近親菌株，重組后的新個體具有更大的雜種優(yōu)勢。作為原生質體融合的二親本都應該有一定的遺傳標記，便于重組體的檢出。常用的遺傳標記有：帶隱性性狀的營養(yǎng)缺陷、抗性標記、熱致死、孢子顏色和菌落形態(tài)等作為標記。實際應用時究竟采用哪各遺傳標記，可以根據試驗目的確定。1、親本及遺傳標記的選擇HerecomesyourfooterPage52、原生質體制備原生質體的分離收集純化活性鑒定保存制備流程HerecomesyourfooterPage6制備原生質體，是原生質體技術的前提和基礎，但是不同微生物的細胞壁組成各不相同，所以制備其原生質體的最佳條件也存在著很大差異。早期人們曾探索使用研磨等機械方法和超聲波等物理方法來制備原生質，制備效果都不理想，目前人們主要運用酶法來制備原生質體。人們多傾向于使用復合酶進行處理，常用的酶有纖維素酶、蝸牛酶和幾丁質酶等不同微生物在制備原生質體時所需酶和種類不同，而且所需酶量也存在著差異。適宜的酶濃度是影響原生質體制備的重要因素，酶濃度過大時，酶中往往含有對原生質體有害的酶類(如過氧化物酶、核糖核酸酶等)，隨著酶量的增加，雜酶的濃度也會隨之增加，當達到一定濃度時，必然會影響原生質體的活性；酶濃度過大，易使菌體凝集，難于原生質體化；而且，細胞脫壁太徹底，必然降低原生質體的再生率。2、原生質體制備HerecomesyourfooterPage7滲透壓穩(wěn)定劑：由于原生質體對滲透壓非常敏感，滲透壓穩(wěn)定劑對于原生質體的制備起著重要作用。常用的滲透壓穩(wěn)定劑有KCl,NaCl,CaCl2,MgSO4，等無機鹽和蔗糖、甘露糖、山梨醇等，一般說來，絲狀真菌以無機鹽作為穩(wěn)定劑比較適宜，而酵母菌則使用糖或醇做穩(wěn)定劑比較好。HerecomesyourfooterPage9原生質體再形成有生活能力的菌絲稱為再生。不同微生物的原生質體最適再生條件存在一定的差異培養(yǎng)基：在再生培養(yǎng)基中會添加一些營養(yǎng)物質這些物質可能是作為細胞壁合成的前體物質也可能通過代謝轉化成細胞壁的前體物質或起到促進代謝加速細胞壁合成的作用。菌齡：菌齡過短的菌絲經酶解破壁形成小原生質體，有的細胞器不完全，營養(yǎng)供給不足再生能力也較低；菌齡長的原生質體再生率高。Ca2+：Ca2+主要是通過維系膜結構的完整性來實現原生質體的穩(wěn)定性與活性。3、原生質體再生HerecomesyourfooterPage10原生質體懸浮液未酶解的細菌無菌水稀釋高滲溶液稀釋高滲溶液稀釋培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)計數再生率（%）=再生培養(yǎng)基上總菌落數—酶處理后未原生質體化菌落數原生質體數×100%總菌落數(A)未原生質化細胞（B)再生菌落(C)=C－BA－B×100%再生率及其計算HerecomesyourfooterPage11HerecomesyourfooterPage13聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG分子中常有醚鍵，使其顯示出弱的負電荷，可與水、蛋白質、糖類分子的正電基團形成氫鍵，而使原生質體連在一起發(fā)生凝集，這種作用還可以由于Ca

+

的存在而加強。為了發(fā)揮PEG促進細胞融合的效力，必須采用較高的濃度(40~50%，分子量為6000)，但PEG在高濃度下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。PEG誘導細胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便等特點，在細胞融合領域取得了可喜的成績，大量的研究仍采用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細胞損傷大、殘存有毒性、融合率較低及經驗性大等缺陷。近年來，一種物理融合技術—細胞電融合技術迅速崛起并顯示出強大的生命力。PEG融合法HerecomesyourfooterPage14從野生型或突變型菌株中選擇兩親本收集菌體，酶解，獲取原生質體以107—108ml-1

的濃度混合加入30%—50%PEG及適量的CaCl2、MgCl2維持在一定pH值的滲透壓穩(wěn)定劑中，適溫處理1—10min再生培養(yǎng)基稀釋4—5倍低速離心數分鐘除去上清液，收集沉淀物0.1mol/LCaCl2洗滌兩次用融合液懸浮制備的融合體原生質融合過程HerecomesyourfooterPage15融合體中除重組體外，還有異核體或部分結合子、雜合二倍體或雜合系，這些都會在平板上形成菌落，檢出融合體的方法有多種，在育種工作中可根據實驗目的和微生物的不同加以選擇。利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體利用抗藥性選擇融合體利用滅活原生質體檢出融合體利用熒光染色法選擇融合體雙親對碳源利用不同而檢出融合體利用形態(tài)差異檢出5、融合體的檢出與分離HerecomesyourfooterPage17這是一種傳統而有效的選擇方法，其檢出原則是：融合的雙親帶有不同的營養(yǎng)缺陷型標記，在分離培養(yǎng)基上只有融合體生長而不能讓雙親形成的原生質體形成菌落。其原理是因為缺陷型的雙親由于喪失了合成某種物質的能力，它們在基體培養(yǎng)基上不能生長、繁殖，部分單親原生質體的同源融合體也不能在基體培養(yǎng)基上形成菌落，只有雙親原生質體的融合體因營養(yǎng)物質互補而形成菌落。利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體HerecomesyourfooterPage18

熒光染色法是事先使雙親染色而攜帶不同熒光色素標記，然后在顯微操作器和熒光顯微鏡下，挑取現時帶有雙親原生質體熒光標記的融合體，直接分離到再生培養(yǎng)基上再生，最后得到融合體。具體方法：制備原生質體時，在酶解液中加入熒光色素，使雙親分別攜帶有不同的熒光標記。它對原生質體活力無影響，攜帶色素的原生質體能正常進行融合并具有再生能力。使用這種方法時，兩種熒光染料的區(qū)分要明顯，并注意染料的濃度和處理時間。利用熒光染色法選擇融合體HerecomesyourfooterPage