石蠟切片VS冰凍切片

石蠟切片VS冰凍切片石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。制作過程較石蠟切片快捷、簡便，因而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診石石蠟切片冷凍切片應(yīng)用對象廣泛應(yīng)用常規(guī)制片手術(shù)中的快速病理診斷保持時間持久保存保存時間較短優(yōu)點(diǎn)成分缺點(diǎn)1、步驟繁多，制片中抗原活性有所降低1、不易做連續(xù)切片2、切取的組織不能過大實驗步驟一、石蠟切片將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過夜。凝固組織中的物質(zhì)成分，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。同時能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行。為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精(無水乙醇)，每次時間為1小時。固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會影響后期的染色效果。常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在透明劑浸漬過程稱先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時。先后移入2以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內(nèi)上，然后置于速凍臺，讓石蠟固定。6.切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水7.貼片與烤片：一般使用恒溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利于石蠟切片的展開，貼好干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。實驗操作簡單。免疫組化：指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)。二、冰凍切片應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。1)將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)。2)如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有3)當(dāng)盒底部接觸液氮時即開始?xì)饣序v，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，4)在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。5)若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?.固定：n2)取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。3)組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架(PE)1)恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。2)切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃~?-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。時(此步可不洗)。?2)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織干涸)。片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。4)第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插5)滴加用PBS稀釋好的二抗(避光)置于分子雜交箱中37℃孵育1小時?；厥?)滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min(工作濃度%染色15min)。片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。8)做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4℃冰箱，可保存一周左右。常見問題及解決方案1.切片上卷且不能形成連續(xù)蠟帶原因：①切片刀不夠鋒利。②切片刀與蠟快的角度不當(dāng)。③蠟塊四周留蠟邊太解決方法：①重新磨刀。②調(diào)整切片刀的角度。③可重新包埋或?qū)⑾瀴K四周熔化，再放入包埋框中補(bǔ)蠟，修理蠟塊時組織塊周圍保留的石蠟以2mm左右為宜。④蠟塊過硬可適當(dāng)加些蜂蠟，或更換熔點(diǎn)較低的石蠟重新包埋。2.切片彎曲且不能形成直帶原因：①蠟塊上下或左右兩邊不平行。②蠟塊與切片刀刀口不平行。③組織塊外形不整齊。④切片刀各處的鋒利程度不一致。解決方法：①將蠟塊四邊反復(fù)修平對稱。②調(diào)節(jié)蠟塊夾持器，使其與切片刀平行。③修整組織塊時，注意修切整齊。④移動切片刀，更換刀口位置。3.切片上出現(xiàn)裂紋原因：①切片刀上有小缺口，或刀口不平整。②組織中可能含有較硬之物質(zhì)，如固定液之結(jié)晶石灰質(zhì)。③包埋時石蠟凍結(jié)太慢。解決方法：①切片刀某處有缺口，可調(diào)換刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口過多且不平整，可先將刀鋒垂直在磨刀石上輕輕磨數(shù)次，然后按常規(guī)磨刀田。②組織中硬性物質(zhì)太多，則不宜用。③糾正包埋時的缺點(diǎn)。一般待蠟塊周圍凝結(jié)一層，即可放入冷水中。4.切片粘在切片刀不易取下原因：切片時有靜電作用，產(chǎn)生靜電吸引，在冬季或氣候干燥時常出現(xiàn)這種情解決方法：可用加濕器。以增加空氣中的水分，而減少靜電作用。?5.切片厚薄不均原因：①切片微動部分失靈，齒輪跳格。②蠟塊太大，過硬，轉(zhuǎn)動時刀刃受震解決方法：①修理切片機(jī)失靈的部分，調(diào)整螺旋。加機(jī)油潤滑零件，必要時需請專業(yè)技術(shù)人員調(diào)整切片機(jī)。②如蠟塊過大，以后取材時注意取材的大小。蠟塊組織過硬，可返回水中浸泡，再重新脫水和包埋。6.切片碎爛或組織脫出并與石蠟分離原因：①組織脫水，透明不夠。②浸蠟時間過長．浸蠟溫度過高。③組織脫出是由于脫水、透明時間不夠，或組織中含有乙醇等，石蠟不易滲入組織中．故導(dǎo)致石蠟與組織分離。④二甲苯使用時間過久。解決方法：①必須按組織大小厚薄選擇脫水、透明時間。②依組織的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)確定浸蠟時間．控制包埋溫度。一般這種情況難以補(bǔ)救。③脫水，透明滲蠟不夠，應(yīng)重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再進(jìn)行滲蠟包埋。④更換二甲苯。7.切片皺褶太多且不能完