基因工程 考試 重點 噬菌體載體

本文格式為Word版，下載可任意編輯——基因工程考試重點噬菌體載體其次章DNA重組克隆的單元操作

練習題噬菌體載體(練習題)

一、填空題

1．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是；二是。2．第一個報道的全測序的單鏈DNA噬菌體是φX174，DNA長5386個堿基對，共個基因，為一環(huán)狀DNA分子，基因組的最大特點是。

3．λ噬菌體的基因組DNA為kb，有多個基因。在體內，它有兩種復制方式，擴增時(早期復制)按復制，成熟包裝(晚期復制)則是按復制。它有一個復制起點，進行向復制。λ噬菌體的DNA既可以以線性存在又可以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。其原因主要是在λ噬菌體線性DNA分子的兩端各有一個個堿基組成的自然黏性末端。這種黏性末端可以自然成環(huán)。成環(huán)后的黏性末端部位就叫做位點。4．根據噬菌體的包裝能力，將野生型λ噬菌體的基因組DNA改造成插入型載體，該載體的最小分子大小約為kb，插入的外源片段最大不超過kb。

5．野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是和。6．黏粒(cosmid)是質?！删w雜合載體，它的復制子來自、COS位點序列來自，最大的克隆片段達到kb。

7．有兩類改造型的λ噬菌體載體，即插入型和取代型。從酶切點看，插入型為個，取代型為個。8．野生型的丸噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：(1)(2)(3)。9．M13單鏈噬菌體的復制分為三個階段：(1)(2)(3)。10．噬菌粒是由質粒和噬菌體DNA共同構成的，其中來自質粒的主要結構是，而來自噬菌體的主要結構是。

11．M13單鏈噬菌體基因2和基因4之間的IG區(qū)有三個最重要的功能，即(1)(2)(3)。

12．野生型的M13有10個基因，分為三個功能集團，其中與復制有關的兩個基因是：和。

13．以λ噬菌體載體和黏粒載體構建文庫時，起始DNA的長度是不同的，前者為kb，后者為kb。

14．λ噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長度應在噬菌體基因組的的范圍內。

二、判斷題

1.取代型載體(replacementvector)是指同一種限制性內切核酸酶在),DNA中具有兩個切點，外源DNA通過取代這兩個切點間的片段被克隆。

2.現(xiàn)在最常用的pUC載體是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位點和易于選擇的分子標記，并且是松弛型復制。另外，這種載體可在輔助質粒的幫助下合成單鏈DNA。

3.噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9載體是集質粒和絲狀噬菌體有利特征于一身的載體，既能合成單鏈DNA,又能合成雙鏈DNA。

4.λ噬菌體DNA和M13單鏈噬菌體DNA在成熟前的DNA復制都是用滾環(huán)模型。5.M13噬菌體每個世代裂解宿主后，可釋放100個子代噬菌體。

6.以黏粒為載體的重組體雖然在平板上生長的速度不同，但是轉化子中插入片段的擴增量

是一致的。

三、選擇題(單項選擇或多項選擇)

1.限制性內切核酸酶EcoRI在野生型的丸噬菌體DNA中有5個切點、HindⅢ有7個切點，BamHI也有5個切點。調整這些酶切位點的數(shù)量，主要通過()(a)體內突變(b)完全酶切后連接

(c)部分酶切(d)先用甲基化酶修飾后再酶切

2.PBluescriptMl3載體在多克隆位點的兩側引入了T7和T3兩個噬菌體的啟動子，這樣增加了該載體的功能，如：

(a)可以對插入到多克隆位點的外源片段進行轉錄分析(b)利用這兩個啟動子的通用引物進行PCR擴增(c)利用通用引物進行序列分析

(d)利用這兩個啟動子進行定點突變上述四種功能中哪一種是不正確的?()

3.下面關于細菌人工染色體(BAC)的特征描述，除了(C)外都是正確的。(a)通過電激法將大質粒轉化大腸桿菌比酵母的轉化率提高了10—100倍(b)BAC載體在細菌中以環(huán)形超螺旋狀態(tài)存在，使分開操作起來相對簡單(c)BAC載體在大腸桿菌宿主保持高拷貝

(d)克隆到BAC載體上的外源片段可以直接進行測序以獲得末端序列

4.以黏粒為載體轉染受體菌后，平板上生長的菌落會大小不一、生長速度不一的現(xiàn)象，其原因是()

(a)營養(yǎng)成分不足

(b)重組后的質粒復制不穩(wěn)定

(c)重組后的黏粒整合到宿主染色體上(d)重組體中插入片段的大小不同

5.M13K07是一種輔助噬菌體DNA,可用它幫助噬菌粒制備單鏈DNA,這是由于()(a)M13K07能夠進行滾環(huán)復制，得到大量的單鏈噬菌體DNA(b)M13K07能夠提供成熟包裝的蛋白(c)M13K07提供了成熟包裝所需的信號(d)M13K07的10個基因都是正常的

6.黏粒(cosmid)是一種人工建造的載體，()(a)它具有COS位點，因而可進行體外包裝(b)它具有質粒DNA的復制特性(c)進入受體細胞后，可引起裂解反應(d)進入受體細胞后，可引起溶源化反應

7．Mu噬菌體也是一種轉座元件，這種轉座元件()（a）可引起寄主的突變

（b）可用于細胞內的基因工程（c）具有轉座酶基因（d）以上說法都正確

8．關于M13的IGIX,以下說法中哪一項不妥當?()(a)具有正負鏈的復制起點

(b)具有噬菌體DNA被包裝的信號(c)具有150個堿基的AT富集區(qū)

(d)具有八個回文序列，可形成五個發(fā)夾環(huán)

9.M13噬菌體基因組編碼10個基因，在它的成熟過程中起調理作用的蛋白是()（a）gp2蛋白(b)gp5蛋白(c)gp7蛋白(d)gp9蛋白

四、簡答題

1．在轉導過程中，尋常需要把受體菌和在供體中生長的噬菌體懸浮液分別鋪在選擇性培養(yǎng)基上，為什么?

2．如何將野生型的九噬菌體改造成為一個理想的載體?

3．用SalI切割從噬菌體J2分開的DNA時，得到8個片段，分別是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。但是，用SaII切割從被感染的寄主細胞中分開到的J2噬菌體DNA時，只得到7個片段，分別是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb，根據這些結果，您得到哪些信息?

4．在cⅠ基因正常時為什么也會出現(xiàn)渾濁的噬菌斑?不正常則是清亮的噬菌斑?5．λ噬菌體DNA被包裝到噬菌體的頭部，需要哪些基本條件?為什么?

五、問答題

1．為什么野生型的λ噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?2．什么是藍白斑篩選法?

3．藍白斑篩選法為什么也會有假陽性?4．什么是cI篩選法?

5．λ噬菌體載體具有哪些優(yōu)點與不足?

6．什么是M13的IG序列區(qū)?有何特點和功能?

7．將野生型的M13改造成基因工程載體，首先是進行酶切位點的改造，請問M13中的EcoRⅠ最初是如何引入的？

8．以置換型λ噬菌體作為載體進行克隆時，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體？9．M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點？10．黏粒載體具有哪些特點與不足？

11．輔助噬菌體DNA和相應的噬菌粒是如何協(xié)同工作的？

噬菌體載體(參考答案)

一、填空題

1．它在細菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴增；對某些噬菌體(如λ噬菌體)的遺傳結構和功能研究得比較明白，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡2．10；基因的重疊

3．48．5；60；凱恩斯模型；滾環(huán)；雙；12；COS4．36；14

5．沒有適合的限制性內切核酸酶識別位點；選擇標記6．質粒；丸噬菌體；457．1；2

8．(1)分子量大，(2)酶的多切點，(3)無選擇標記9．(1)SS~RF；(2)RF~RF；(3)RF-*SS10．復制區(qū)；IG區(qū)

11．(1)正鏈復制起點；(2)負鏈復制起點；(3)包裝信號12．基因Ⅱ；基因Ⅴ13．100kb；200kb14．75％一105％二、判斷題

1．錯誤。不一定是同一種酶，假使兩種不同的限制性內切核酸酶在載體上各只有一個切點，兩切點間的片段被取代后又不影響噬菌體的生活力，也是取代型載體。2．錯誤。pUCl8沒有IG區(qū)，不可能形成單鏈。

3．錯誤。假使沒有助手噬菌體的存在，則不能形成單鏈DNA。4．正確。

5．錯誤。M13噬菌體不會使宿主裂解，導致噬菌體從細胞釋放出來。

6．錯誤。由于重組體在乎板上生長的速度不同，轉化子中插入片段的擴增量就不一致，三、選擇題(單項選擇或多項選擇)

1．a；2．d；3．c；4．d；5．d；6．a，b，c；7．d；8．d；9．b四、簡答題1．答：

這些平板起對照作用。第一個對照試驗可檢測和估計自發(fā)突變?yōu)橐吧偷念l率；其次個對照試驗確證噬菌體懸液中無菌狀況(即不能有任何活的供體細菌)。2．答：

(1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))；(2)削減酶切位點；(3)添加選擇標記；(4)引入終止突變3．答：

(1)J2噬菌體是一種雙鏈線性的DNA分子；(2)基因組全長是47．5kb；(3)進入宿主后成環(huán)狀；(4)5．3和3．6kb的片段分別位于線性DNA的兩端。4．答：

正常時，既有裂解途徑也有溶源化途徑。不正常則全部進入裂解途徑。5．答：

(1)兩個COS位點；(2)線性DNA；(3)大小在丸噬菌體基因組的75％一105％的范圍之內。五、問答題1．答：

(1)噬菌體DNA沒有容載能力，由于噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將λ噬菌體改造成載體，必需削減分子量。(2)野生型的λDNA對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆。(3)沒有可供選擇的標記。

(4)野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。2．答：

這種方法是根據組織化學的原理來篩選重組體。主要是在λ載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌β—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的λ載體轉入lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成淺藍色的噬菌斑。外源基因插入lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解X-gal的能力，轉人lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。3．答：

β—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以進行修飾，并不影響酶的活性或。肽的互補性。假使插入的外源DNA引起。肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會形成白色噬菌斑。假使插入DNA的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止密碼的話，依舊會形成藍色噬菌斑。這種插人物的長度

可達幾百個堿基對。M13載體的這種性質可以用來檢測和選擇產生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。4．答：

CⅠ基因的功能是促使噬菌體進入溶源化，但在正常狀況下，它的噬菌斑是不明白的，有點渾濁。這是由于在λ噬菌體感染時，有少數(shù)細胞進入溶源化途徑，這些細胞生長在噬菌斑中，就造成了噬菌斑渾濁。由于cⅠ基因的產物——阻遏物的失活，不會有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很簡單將重組體與非重組體區(qū)別開來。cI阻遏物的名字就是指在該基因中插入一段DNA后會使噬菌斑的形態(tài)變得清亮(c=clear)。5．答：優(yōu)點：

(1)λ基因組中有1／3的非必需區(qū)，可以被置換，改造成載體后，克隆的片段較大(可達20kb)，而質粒載體的克隆片段只有幾個kb；

(2)用噬菌體DNA作為載體，即使不進行體外包裝，轉染的頻率也比質粒轉化的效率高，包裝后的效率就更高了；

(3)λ可通過溶源化反應整合到寄主染色體上，當不需要外源基因大量表達時，可讓它以溶源性存在，若要表達，可通過誘導即可進入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA的拷貝數(shù)就會好多。不足：

(1)需要包裝比較麻煩，包裝率又不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費用又高；(2)沒有質粒的用途廣泛。6．答：

在M13基因組中的基因2與基因4之間有一個長度為507個核苷酸的基因區(qū)間，簡稱IG(intergenicregion)，占基因組的8％。該區(qū)具有以下特點：(1)具有正、負鏈的復制起點；

(2)具有噬菌體DNA被包裝到噬菌體顆粒的包裝信號；(3)具有150個堿基的AT富集區(qū)；

(4)有5個回文序列，能夠形成5個發(fā)夾環(huán)，回文序列A是包裝信號。IG區(qū)在M13噬菌體的生命周期中的4個過程中起重要作用：(1)噬菌體DNA成熟包裝到噬菌體顆粒中的包裝識別位點；(2)RNA引物合成的位點，合成的引物用于(一)鏈的合成；

(3)(＋)鏈合成的起始位點，全長140bp,分成兩個結構域，結構域A長為40bp,是復制起始的基本位點，它被gp2識別，產生一個切口開始復制，并作為復制的終止點。結構域B長為100bp，起加強子作用，幫助gp2在結構域A起作用。(4)(＋)鏈合成的終止位點。7．答：

用識別4個堿基的限制酶HaeⅢ切割M13雙鏈DNA，發(fā)現(xiàn)HaeⅢ在M13上有10個切點。為了將M13構建成克隆載體，首先用HaeⅢ將RFl進行部分消化，使之產生單一切點的全長的線性M13DNA。

HaeⅢ在M13上有10個切點，因此產生的線性DNA的末端可能是這10個切點的任何一個部位產生的。將外源DNA同線性的M13DNA連接起來，只有在非必需區(qū)插入并連接起來的重組體能夠進行復制，從必需區(qū)插入的重組DNA不能復制，因此將會被丟失。

根據上述的原理，用HaeⅢ部分酶切野生型的RFMl3DNA,然后同lac插人片段連

接，感染后篩選重組體M13mpl，該重組體中的插入片段是從IG區(qū)的5868位的HaeⅢ位點插入的。

通過對lac插入片段的序列分析發(fā)現(xiàn)，只要將β半乳糖苷酶基因內的密碼子5的堿基G換成A即可產生一個EcoRI的識別位點(GAATTC)。

由于知道G中的06甲基化將會導致G同U的配對，將單鏈的M13mpl的(+)鏈用甲基化試劑N—甲基—N—亞硝酸脲進行處理，用突變的DNA去轉染細菌，分開RF型DNA，由于分開的RFDNA并非都具有EcoRI位點的突變體，所以用EcoRI切割后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢查，根據線性DNA與環(huán)狀DNA的電泳遷移率的不同，將線性化的DNA分開出來，重新連接成環(huán)，再進行轉染。分開到三個克隆，每個克隆都有一個EcoRI的位點，但所在位置有所不同，將它們分別命名為：M13mp2、M13mp3、M13mp4。8．答：

改造的置換型噬菌體載體，重組人外源片段之后，總體積不能超過λ基因組的105％，不能少于λ基因組的75％。以置換型λ噬菌體DNA作為載體，首先要分開左、右兩臂同外源DNA重組。假使沒有外源片段，僅是兩臂連接，長度短于λ基因組的75％，不能被包入噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。假使插入了外源片段后，總長度超過丸基因組105％后，也不能包入噬菌體顆粒，自然不能形成噬菌斑。9．答

M13克隆系統(tǒng)具有好多優(yōu)點：

(1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大，有報道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長6～7倍的DNA(插入片段可達40kb)。

(2)可直接產生單鏈DNA，這對于DNA測序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。

(3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉染宿主，并可根據人工加上的選擇標記進行篩選。

M13克隆系列的不足：

(1)較大的外源片段插入后，在擴增過程中往往不夠穩(wěn)定，一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機率越大。