蛋白質(zhì)的定性定量分析及保存

蛋白質(zhì)含量的測定方法

蛋白質(zhì)相對分子量測定

純化蛋白質(zhì)的濃縮、干燥和保存

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析

(westernblotting)蛋白質(zhì)組學定量研究常見方法現(xiàn)在是1頁\一共有64頁\編輯于星期五第一節(jié)蛋白質(zhì)的含量測定現(xiàn)在是2頁\一共有64頁\編輯于星期五目前蛋白質(zhì)的直接定量分析技術(shù)只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍）、BCA法、紫外分光光度法等。現(xiàn)在是3頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)的比色法含量測定基于蛋白質(zhì)的元素組成特點基于蛋白質(zhì)的化學顯色反應基于蛋白質(zhì)的光吸收特性現(xiàn)在是4頁\一共有64頁\編輯于星期五一、基于蛋白質(zhì)元素組成的特點

凱氏定氮法各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16現(xiàn)在是5頁\一共有64頁\編輯于星期五凱氏定氮法1883年，丹麥化學家Kjeldahl建立，基于蛋白質(zhì)的含氮量在16%左右。蛋白質(zhì)+硫酸→CO2+H2O+NH3→硫酸銨+強堿→氨優(yōu)點：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠缺點：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值；蛋白質(zhì)氨基酸有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣?，F(xiàn)在是6頁\一共有64頁\編輯于星期五二、基于蛋白質(zhì)的光吸收特性

紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰?，F(xiàn)在是7頁\一共有64頁\編輯于星期五原理芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白質(zhì)中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收?？赏ㄟ^測定該波長的光吸收度，計算蛋白質(zhì)濃度。C＝A/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數(shù)，L為光程。K值可通過各種方法得到（包括軟件分析等）。現(xiàn)在是8頁\一共有64頁\編輯于星期五所需時間

幾分鐘優(yōu)點

快速缺點

核酸可引起強干擾作用靈敏度0.2mg/ml～2mg/ml

對蛋白質(zhì)無破壞性

不是嚴格的定量，適用于測定蛋白質(zhì)粗提液現(xiàn)在是9頁\一共有64頁\編輯于星期五計算方法

標準曲線法

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項

石英比色杯

調(diào)零所用溶液

配制標準蛋白所用溶液

光密度范圍現(xiàn)在是10頁\一共有64頁\編輯于星期五二、Bradford檢測法由Bradford等人于1976年建立

這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質(zhì)定量試劑盒基于蛋白質(zhì)的化學顯色反應現(xiàn)在是11頁\一共有64頁\編輯于星期五原理

該法是基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)。藍色復合物在595mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量現(xiàn)在是12頁\一共有64頁\編輯于星期五所需時間10min優(yōu)點

快速（反應時間僅需2min）

敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)損失缺點

用這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不可逆的變性靈敏度25ug/ml～200ug/ml

對各種純化蛋白質(zhì)反應不同現(xiàn)在是13頁\一共有64頁\編輯于星期五計算方法

標準曲線法注意事項

標準曲線在2.5ug～15ugBSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系

反應10～15min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀

若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確現(xiàn)在是14頁\一共有64頁\編輯于星期五三、Lowry檢測法

1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎(chǔ)上建立這一標準、快速的蛋白質(zhì)定量檢測方法已得到廣泛應用，在檢測之前可通過蛋白質(zhì)沉淀將干擾物質(zhì)去除基于蛋白質(zhì)的化學顯色反應現(xiàn)在是15頁\一共有64頁\編輯于星期五原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量現(xiàn)在是16頁\一共有64頁\編輯于星期五所需時間40min優(yōu)點

一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法

不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點

某些試劑不穩(wěn)定靈敏度5ug/ml～100ug/ml

干擾物質(zhì)多

反應速度慢

使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性現(xiàn)在是17頁\一共有64頁\編輯于星期五計算方法

標準曲線法注意事項

在加入試劑30min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱

許多干擾物質(zhì)降低顏色反應

高鹽濃度可引起沉淀現(xiàn)在是18頁\一共有64頁\編輯于星期五四、BCA(二喹啉甲酸)檢測法

這是近年來新研制的一種改進的Lowry測定法，反應簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質(zhì)的影響，有試劑盒出售。基于蛋白質(zhì)的化學顯色反應現(xiàn)在是19頁\一共有64頁\編輯于星期五原理

在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含量?，F(xiàn)在是20頁\一共有64頁\編輯于星期五優(yōu)點

與Lowry法相比幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響缺點

蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性靈敏度

標準檢測：10～1200ug/ml

單一試劑

終產(chǎn)物穩(wěn)定

反應時間長

微量檢測：0.5～10ug/ml現(xiàn)在是21頁\一共有64頁\編輯于星期五計算方法

標準曲線法注意事項

與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值

為促進BCA法的反應進程，可將樣品適當加熱現(xiàn)在是22頁\一共有64頁\編輯于星期五其它蛋白質(zhì)的定性定量方法1.蛋白質(zhì)的染色定量2.ELISA測定3.放射免疫測定現(xiàn)在是23頁\一共有64頁\編輯于星期五第二節(jié)蛋白質(zhì)相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜(ESI-MS)現(xiàn)在是24頁\一共有64頁\編輯于星期五1.SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS）和蛋白質(zhì)組成復合物，使蛋白質(zhì)帶的負電荷的量遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。＝q/f＝q/6r，所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。現(xiàn)在是25頁\一共有64頁\編輯于星期五在SDS中遷移的蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率的關(guān)系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr為蛋白質(zhì)相對分子量，K、K1為常數(shù)，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊脂糖凝膠中的遷移現(xiàn)在是26頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是27頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是28頁\一共有64頁\編輯于星期五在半對數(shù)坐標紙上做出標準曲線注意：標準曲線的斜率會根據(jù)所用凝膠濃度而發(fā)生微小的改變?，F(xiàn)在是29頁\一共有64頁\編輯于星期五2.凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：

lgMr＝K1－K2

Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標準物的Ve，并以它們的lgMr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量?，F(xiàn)在是30頁\一共有64頁\編輯于星期五SDS與凝膠過濾法是互補的凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質(zhì)每條多肽鏈的分子量。綜合應用這兩種方法，可得到待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息?，F(xiàn)在是31頁\一共有64頁\編輯于星期五例如：凝膠過濾法得到的蛋白質(zhì)分子量：180kDSDS（不加還原劑）結(jié)果：45kDSDS（加還原劑）結(jié)果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結(jié)論是：該蛋白質(zhì)由4個相同的亞基組成，每個亞基由兩條多肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成，兩條多肽鏈的分子量分別為15kD和30kD。現(xiàn)在是32頁\一共有64頁\編輯于星期五3.質(zhì)譜法是最精確的分子量測定方法質(zhì)譜（MassSpectrometry，MS）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序排列的圖譜。由于ESI和MALDI兩大電離技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應用于蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，包括蛋白質(zhì)分子量測定。精確度0.01～0.1％?，F(xiàn)在是33頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是34頁\一共有64頁\編輯于星期五第三節(jié)純化蛋白質(zhì)的濃縮、干燥和保存現(xiàn)在是35頁\一共有64頁\編輯于星期五一、蛋白質(zhì)的濃縮超濾法使用特制薄膜對溶液中的溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的技術(shù)。常用離心力使蛋白質(zhì)透過濾膜，而使蛋白質(zhì)截留在膜內(nèi)?，F(xiàn)在是36頁\一共有64頁\編輯于星期五冷凍干燥法在冷凍狀態(tài)下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質(zhì)的技術(shù)，保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的最好方法。注意：必須保證蛋白質(zhì)始終處于冷凍狀態(tài)（在－70℃冰箱預冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）?，F(xiàn)在是37頁\一共有64頁\編輯于星期五吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質(zhì)溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機溶劑沉淀；免疫沉淀?，F(xiàn)在是38頁\一共有64頁\編輯于星期五5.其它方法濃縮膠濃縮法離子交換法吸附法蒸發(fā)法現(xiàn)在是39頁\一共有64頁\編輯于星期五二、蛋白質(zhì)的干燥常壓吸收干燥真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥現(xiàn)在是40頁\一共有64頁\編輯于星期五三、蛋白質(zhì)的保存影響蛋白質(zhì)成品保存的因素：

1）空氣

2）濕度

3）水分

4）光線

5）pH值

6）時間現(xiàn)在是41頁\一共有64頁\編輯于星期五2.蛋白質(zhì)的保存方法低溫下保存制成干粉或結(jié)晶保存在保護劑下保存

a.惰性的生化或有機物

b.中性鹽

c.巰基試劑現(xiàn)在是42頁\一共有64頁\編輯于星期五第四節(jié)蛋白質(zhì)組學定量研究常見方法現(xiàn)在是43頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)組學定量研究常見方法1：常規(guī)雙向電泳2：DIGE3：15N等同位素標記4：ICAT5：iTRAQ6：SILAC現(xiàn)在是44頁\一共有64頁\編輯于星期五1：雙向電泳

基于2D的經(jīng)典定量分析方法。

1、樣品準備和定量：抽提對照組和各種不同實驗組的蛋白質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)分離：蛋白質(zhì)經(jīng)過2D分離后染色（銀染、考染等）。

3、蛋白質(zhì)的定性與定量分析：通過與對照組相ImageMaster7.0分析出實驗組中差異點，質(zhì)譜鑒定差異點蛋白質(zhì),同時應用軟件分析出其表達量的變化。現(xiàn)在是45頁\一共有64頁\編輯于星期五2：DIGE簡介：

DIGE—

雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基反應而使蛋白質(zhì)被標記，標記后蛋白質(zhì)的等電點和分子量基本不受影響，等量混合標記好的蛋白質(zhì)后進行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達量的變化則通過不同熒光的強度來體現(xiàn)。技術(shù)優(yōu)勢：

1：高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個樣品，減輕了工作量；

2：與常規(guī)銀染相比靈敏度更高；

3：檢測動態(tài)范圍更大；

4：定量精確,采用內(nèi)標而消除了膠與膠之間的實驗誤差；

5：統(tǒng)計學分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到統(tǒng)計學可信的結(jié)果，降低了操作者之間的偏差?，F(xiàn)在是46頁\一共有64頁\編輯于星期五2：DIGE

DIGE熒光定量方法流程圖.1、樣品準備：提取對照組和不同實驗組的蛋白質(zhì),定量,cy3和cy5交叉標記，同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后cy2標記，作為內(nèi)標。

2、蛋白質(zhì)分離：等量混合三種熒光素標記后的蛋白質(zhì)，2D電泳分離，熒光顯色。

3、蛋白質(zhì)定量分析：ImageMaster7.0（DIGE)分析同一蛋白質(zhì)不同處理后的表達量變化。現(xiàn)在是47頁\一共有64頁\編輯于星期五3：代謝標記法—15N標記法簡介：在培養(yǎng)基中添加15N，細胞經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)將完全被同位素標記，等量混合標記與沒有標記同位素的樣本、液相色譜和SDS分離，質(zhì)譜鑒定和定量。根據(jù)質(zhì)譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。優(yōu)點：高效性：15N標記法是體內(nèi)標記技術(shù)，標記效率可高達95%；重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異；靈活性：在培養(yǎng)基中添加同位素標記15N，操作方便。缺點：

（1）只有已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，才可以對14N/15N標記的蛋白質(zhì)或肽段的相應質(zhì)量位移進行預測。（2）由于使用的15N培養(yǎng)基純度>96%，無法完全置換14N,所以15N標記的肽段在質(zhì)譜中會有額外的同位素峰?，F(xiàn)在是48頁\一共有64頁\編輯于星期五4：化學標記法—ICATA:ICAT試劑結(jié)構(gòu)，包括3個部分，SH反應集團，biotin標簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個氘）和輕型（不含氘）B:ICAT標記定量技術(shù)流程，來源不同處理的蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標記，標記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標記的多肽，質(zhì)譜分析，依據(jù)MS質(zhì)譜峰圖強度進行定量，MS/MS鑒定肽段?，F(xiàn)在是49頁\一共有64頁\編輯于星期五4：化學標記法—ICATICAT法的缺點：（1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)。（2）ICAT分子量相對較大（約500Da），與蛋白質(zhì)連接后可能會造成分子的空間位阻（3）ICAT分子量相對較大（約500Da），由于在MS分析中標簽仍保留在每個肽上，使得在碰撞誘導解吸（CID)條件下，很容易被片段化，那么標簽特異化的片段離子就會使串聯(lián)質(zhì)譜分析標記肽段的過程復雜化，（4）ICAT分子量相對較大（約500Da），這對小肽而言是一個較大的修飾物，會增加數(shù)據(jù)庫搜索的復雜性（5）標記時通常需要延長時間來保證ICAT與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，這可能會造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發(fā)生氨基酸局部衍化。（6）與原子結(jié)合的硫醚鍵化學穩(wěn)定性較低，可能會自發(fā)發(fā)生β-消除反應使部分標簽斷裂?，F(xiàn)在是50頁\一共有64頁\編輯于星期五5:化學標記法—iTRAQ簡介：

iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。iTRAQ結(jié)構(gòu)

iTRAQ包括三部分：報告部分、肽反應部分、平衡部分。

1、報告部分：有八種，因此iTRAQ可同時標記8組樣品。

2、肽反應部分：能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價連接而標記上肽段，幾乎可以標記所有蛋白質(zhì)。

3、平衡部分：保證iTRAQ標記的同一肽段的質(zhì)荷比相同?，F(xiàn)在是51頁\一共有64頁\編輯于星期五5:化學標記法—iTRAQ與傳統(tǒng)基于雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)優(yōu)勢：1：靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；2：分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3:高通量：同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質(zhì)進行分析；4：結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；5：自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好?，F(xiàn)在是52頁\一共有64頁\編輯于星期五5:化學標記法—iTRAQiTRAQ法。

1：樣本經(jīng)過不同處理后，提取蛋白質(zhì);2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后胰蛋白酶酶切;3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ標記;4：等量混合各種iTRAQ試劑標記的肽段;5：MS/MS質(zhì)譜檢測及分析?，F(xiàn)在是53頁\一共有64頁\編輯于星期五6:SILACSILAC即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)，其基本原理是在細胞培養(yǎng)時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg,細胞在傳代培養(yǎng)過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質(zhì)，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過SDS分離和質(zhì)譜分析，通過比較一級質(zhì)譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。由于SILAC標記技術(shù)是體內(nèi)標記技術(shù)，幾乎不影響細胞的功能，同時靈敏度高，因此其在蛋白質(zhì)組學相關(guān)領(lǐng)域中得到了廣泛的應用，如比較蛋白質(zhì)組學，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)與DNA相互作用，蛋白質(zhì)與RNA相互作用等領(lǐng)域。現(xiàn)在是54頁\一共有64頁\編輯于星期五6:SILAC

技術(shù)優(yōu)勢——目前比較蛋白質(zhì)組學最先進方法

（1）高效性：SILAC是體內(nèi)標記技術(shù)，標記效率可高達100%；（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異；（3）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測測到納克級水平；（4）相容性：可以對多種在DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記；（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便?，F(xiàn)在是55頁\一共有64頁\編輯于星期五6：SILACSILAC法。

1、標記：在缺乏Lys和Arg的培