生物技術(shù)基因工程篇

生物技術(shù)基因工程篇第1頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一基因工程(geneticengineering)基因工程又稱DNA重組技術(shù)，即在體外把兩種或者兩種以上不同來源的DNA分子重新組合成新的DNA分子，通過載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，將所需要的經(jīng)過修飾的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生人類所需要的基因或產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)基因生物。第2頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一基因工程的基本步驟分離/制備目的基因選擇載體使目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體以重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（細(xì)菌或其他細(xì)胞）篩選出能夠表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞，使這些細(xì)胞擴(kuò)增、繁殖獲得大量拷貝的目的基因使目的基因在宿主細(xì)胞表達(dá)出編碼的多肽第3頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一基因工程（原核表達(dá)系統(tǒng)）操作的基本步驟第4頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一一、目標(biāo)基因的制備1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法3、人工合成法4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第5頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）第6頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一優(yōu)點：原理簡單，操作簡便，具有一定的應(yīng)用范圍

基因組文庫（genomiclibrary）的制備：用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一段與一個載體連接成重組DNA，并引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，稱基因文庫。缺點：所獲得的DNA含有內(nèi)含子，不能在原核細(xì)胞中表達(dá)。第7頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法

mRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA第8頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一3、人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列※用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因核苷酸序列化學(xué)合成目的基因按密碼子推算第9頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一

利用化學(xué)合成法已成功合成人生長激素釋放因子、胸腺素、血管升壓素、胰島素、α干擾素等基因，并進(jìn)一步生產(chǎn)出相應(yīng)的藥物。第10頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第11頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第12頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一二、載體的選擇

載體（vector）：運載外源性DNA有效地進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)的工具。

載體應(yīng)具備的條件分子相對較小（3~10kb）,能進(jìn)行復(fù)制，且具有高拷貝數(shù);具有幾個單一的酶切位點，酶切位點應(yīng)在復(fù)制子以外適當(dāng)?shù)奈恢?能接納盡可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，載體在受體細(xì)胞中的復(fù)制不受影響。第13頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一④必須有便于篩選的明顯標(biāo)志，如耐藥性和空斑形成等,以便于陽性克隆細(xì)胞容易被選出；有促進(jìn)外源性DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)；對受體細(xì)胞無害。

※天然載體有很多缺點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想載體的要求，通常使用的載體都是經(jīng)過改造過的載體。第14頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒（plasmid）噬菌體（phage）病毒(vector)

載體的種類按來源分

克隆載體(cloningvector)按作用分表達(dá)載體(expressionvector)第15頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的存在與否一般對細(xì)菌的生存沒有決定性的影響。帶有選擇性遺傳標(biāo)志，如基因的產(chǎn)物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）。在基因工程中應(yīng)用廣泛

。實際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322,pUC19等。第16頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制有兩種類型嚴(yán)密型質(zhì)粒：復(fù)制需要蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在，它的復(fù)制與宿主細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，每個宿主細(xì)胞內(nèi)只有1~5個嚴(yán)密型質(zhì)粒。

松弛型質(zhì)粒：復(fù)制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在沒有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制，每個宿主細(xì)胞內(nèi)可存有10~200個以上的松弛型質(zhì)粒，在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色質(zhì)復(fù)制停止的情況下，可繼續(xù)大量擴(kuò)增至上千份。

利用此原理可在質(zhì)粒擴(kuò)增時，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成，達(dá)到進(jìn)一步擴(kuò)增松弛型質(zhì)粒的目的。第17頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一PBR322抗氨芐青基因抗四環(huán)素基因第18頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒的構(gòu)建第19頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒攜帶外源基因第20頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第21頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一（1）λ噬菌體2、噬菌體載體感染細(xì)菌的病毒特點：雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形）兩端具有12個nt單鏈互補粘性末端COS位點具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度）可在體外包裝成病毒顆粒，可高效感染宿主細(xì)胞（大腸桿菌）容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。第22頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第23頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一根據(jù)生活周期分

溶菌性：在細(xì)菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂解，釋放噬菌體溶源性：將其DNA整合入細(xì)菌基因組DNA中，與宿主DNA一起復(fù)制，然后傳給子代，宿主細(xì)胞不發(fā)生裂解。**只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。第24頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的溶源周期和溶菌周期第25頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一類型：

插入型載體：只有一個限制性內(nèi)切酶位點可供插入外源性DNA片段。替代型載體：含有某個限制性內(nèi)切酶的兩個切點，這兩個切點間的片段可以被外源性DNA替代。第26頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第27頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一藍(lán)白篩選載體中含一個LacZ基因

β-半乳糖苷酶

X-gal(無色)X(藍(lán)色)+gal(半乳糖)其中X為顯色底物：5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D半乳糖苷

在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基中

◆非重組的噬菌體轉(zhuǎn)化的宿主菌可以合成β-半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落形成藍(lán)色噬菌斑。

◆重組的的噬菌體因LacZ基因被外源DNA插入而破壞，故其轉(zhuǎn)化的宿主菌不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，因而菌落形成無色噬菌斑。編碼第28頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第29頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第30頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一（2）M13噬菌體（M13phage）特點：單鏈線性DNA分子大腸桿菌被感染后，并不死亡，只是生長緩慢，而新的噬菌體被釋放到菌體外。感染大腸桿菌后，單鏈線性DNA分子可轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從大腸桿菌中分離出雙鏈復(fù)制型的M13還可作為克隆雙鏈DNA的載體具非必需區(qū)(IS)第31頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一從宿主菌體中釋放出來的M13噬菌體粒子只含單鏈DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中兩條中的一條，因此可用來制備單鏈DNA探針，也可以用作DNA測序的模板。篩選：藍(lán)白篩選第32頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一

是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。

由入噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。

在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。（3）粘尾質(zhì)粒(cosmid)/粘性質(zhì)粒/粘粒/cos質(zhì)粒第33頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一cosmid的構(gòu)造特點:

含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位；

一個或多個單一酶的限制位點；

帶有入噬菌體粘性末端；

分子小，可容納大的外源DNA片段。第34頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一將染色體端粒序列（TEL）、自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒（CEN）以及必要的選擇標(biāo)記（HISA4和TRP）基因和多克隆位點（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞YAC。（1）酵母為宿主的載體3、真核細(xì)胞為宿主的克隆載體人工構(gòu)建的酵母質(zhì)粒

酵母人工微小染色體（YAC）第35頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第36頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一（2）以植物細(xì)胞為宿主的基因克隆載體Ti質(zhì)粒第37頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一（3）DNA病毒載體1）SV40載體（猴腎病毒）完整的SV40載體利用SV40元件組建的穿梭質(zhì)粒載體，如pSVK3質(zhì)粒：由噬菌體三種載體構(gòu)建而成質(zhì)粒SV402）乳頭瘤病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。3）腺病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。第38頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一

克隆載體(cloningvector)用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。

表達(dá)載體(expressionvector)在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。第39頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一啟動子、核糖體結(jié)合位點、克隆位點、轉(zhuǎn)錄終止信號大腸桿菌表達(dá)載體除克隆載體的特性外還含有：哺乳動物表達(dá)載體除含有原核序列（在E-Coli中的復(fù)制起始點、便于篩選的抗性基因）還包括：啟動子/增強子、克隆位點、終止信號和加poly（A）信號。第40頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一三、目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體

工具酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

能識別DNA分子內(nèi)部的特異的對稱序列,水解磷酸酯鍵，切斷分子。

識別序列的特點

①專一；②常由4~6個堿基組成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-第41頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一

限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。到目前為止已發(fā)現(xiàn)上千種限制性內(nèi)切酶，其中數(shù)十種被經(jīng)常使用。

水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5′端為P，3′端為—OH第42頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一限制酶的命名

EcoRⅠ細(xì)菌的屬名從該細(xì)菌中分離出的第幾個酶細(xì)菌種名細(xì)菌株系第44頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一切口類型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：第45頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一目的基因第46頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一第47頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一

連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。第48頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCC第49頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一DNA連接酶(DNAligase)第50頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化（transformation）

以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。第51頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一受體細(xì)胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞※受體細(xì)胞必須是限制性內(nèi)切酶缺陷型，即R-菌株，使載體或重組DNA不被水解第52頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一受體細(xì)胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞

細(xì)菌細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點：操作簡單、增代時間短、價格低廉；

某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平很高

缺點:表達(dá)多肽分子常不能適當(dāng)?shù)卣郫B,蛋白質(zhì)常無生物活性；

異體蛋白質(zhì)，常對細(xì)菌有毒性作用；

缺乏真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，例如使蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化

第53頁，共59頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)化的方法（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化法Cacl2致敏轉(zhuǎn)化法宿主：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（CompetentCell）：E-coli經(jīng)Cac