氨基酸分析測(cè)定及衍生化方法

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HPLC的使用之一

氨基酸分析測(cè)定及衍生化方法

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呂瑩果1，，張暉2，孟祥勇2，陳能飛3

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，XXXX214122；

3.廣州江大和風(fēng)香精香料有限公司，廣東廣州510660）

HPLC的使用之一

有吸收時(shí)，也可同時(shí)進(jìn)行分開(kāi)和檢測(cè)；其主要缺點(diǎn)是衍生化條件自由度有所限制。由于衍生反應(yīng)在特定反應(yīng)器中進(jìn)行，常造成色譜峰展寬，使分開(kāi)度降低；過(guò)量試劑或試劑水解產(chǎn)物可能造成干擾；尋常需要特定設(shè)備配件。

柱前衍生化，樣品組分經(jīng)特定化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)光或發(fā)色衍生物，再進(jìn)行色譜分開(kāi)測(cè)定。該法有以下優(yōu)點(diǎn)：尋常不考慮衍生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，直到衍生反應(yīng)完全；為使衍生反應(yīng)及衍生產(chǎn)率獲得最正確效果，可任意選定衍生化條件柱前衍生化反應(yīng)的溶劑不必與分開(kāi)時(shí)滾動(dòng)相相匹配；衍生化副產(chǎn)物可進(jìn)行預(yù)處理以降低或消除其干擾。其主要缺點(diǎn)表現(xiàn)為：柱前衍生化反應(yīng)形成副產(chǎn)物可能對(duì)色譜分開(kāi)造成較大干擾，有時(shí)嚴(yán)重影響衍生化反應(yīng)重復(fù)性；衍生物水解、反應(yīng)溶劑雜質(zhì)組分造成大量干擾峰〔17〕。

相比之下，柱前衍生法對(duì)儀器要求相對(duì)更低，且優(yōu)點(diǎn)更為突出，普適性廣，應(yīng)用更為廣泛。3氨基酸柱前衍生化方法

近年來(lái)，柱前衍生RP–HPLC分析氨基酸得到迅速發(fā)展，RP–HPLC要求將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適于反相色譜分開(kāi)并能被靈敏檢測(cè)的衍生物。柱前衍生關(guān)鍵在于衍生試劑選擇，常用柱前衍生試劑一般需具備以下幾個(gè)特點(diǎn)〔18~20〕：（1）摩爾吸光系數(shù)大；

（2）良好發(fā)光或發(fā)色性能，與被標(biāo)示生物基質(zhì)結(jié)合后特性不減弱；

（3）可與被標(biāo)示物通過(guò)物理或化學(xué)作用結(jié)合，未結(jié)合標(biāo)示劑及其水解產(chǎn)物易于清除或分開(kāi)；（4）與背景對(duì)比明顯，以避開(kāi)雜質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度；

（5）標(biāo)記反應(yīng)條件溫柔，確保被標(biāo)示生物基質(zhì)原有化學(xué)性質(zhì)不被破壞；（6）易于合成、保存，無(wú)毒；

（7）形成衍生物在乙睛和甲醇中有足夠溶解度；（8）衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性強(qiáng)。

根據(jù)以上要求，有幾種常用柱前衍生化試劑，具體衍生化方法及結(jié)果評(píng)價(jià)如下。3.1熒光胺

熒光胺（Fluorescamine，簡(jiǎn)稱FA），1972年，Uden-Friend〔21〕等發(fā)現(xiàn)和茚三酮產(chǎn)物通過(guò)氧化脫羧后形成苯乙醛，在過(guò)量茚三酮存在下能迅速與氨基酸形成強(qiáng)熒光產(chǎn)物；隨后鑒定這一中間體結(jié)構(gòu)并命名為熒光胺，熒光胺與氨基酸反應(yīng)方程式如圖1所示。

PITC可與一級(jí)和二級(jí)氨基酸同時(shí)反應(yīng)，衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，凍干衍生產(chǎn)物–20℃可貯存30d，4℃水溶液中可貯存3d，色譜響應(yīng)值無(wú)明顯變化。但樣品制備較為繁瑣，需預(yù)先去除剩余試劑；且雖嚴(yán)格操作，但存在于樣品中痕量PITC試劑也會(huì)縮短分析柱壽命。3.3氯甲酸芴甲酯

氯甲酸芴甲酯（9–fluorenylmethylchlorformate，簡(jiǎn)稱FMOC–Cl），尋常狀況下，F(xiàn)MOC–Cl與氨基酸反應(yīng)，生成一種具有強(qiáng)熒光產(chǎn)物FMOC–AA，反應(yīng)方程式如圖3所示?？捎脽晒鈾z測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為265nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310nm；

也可用紫外檢測(cè)。

尋常狀況下，一、二級(jí)氨基酸、醇、水等都能與熒光胺起反應(yīng)，但只有一級(jí)氨基酸形成熒光衍生物。因此，該試劑具有一定選擇性，能與一級(jí)氨基酸在pH9和室溫條件下瞬時(shí)反應(yīng)，衍生產(chǎn)物具有高熒光強(qiáng)度；而試劑本身則迅速水解成不帶熒光產(chǎn)物，不影響分析，是一種理想柱前衍生化試劑。其熒光激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)475nm〔22~23〕。3.2異硫氰酸苯酯

異硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate，簡(jiǎn)稱PITC），早期主要是作為異硫氰酸甲酯替代物出現(xiàn)〔24〕。隨衍生氨基酸技術(shù)不斷完善，近年來(lái)，PITC法已成為普遍用于RP–HPLC分析氨基酸方法之一。室溫下，PITC與氨基酸反應(yīng)生成苯氨基硫甲酞衍生物（PTA–AA），在原有氨基酸結(jié)構(gòu)中引入苯環(huán)，使氨基酸極性大大降低，衍生反應(yīng)可在5~10min內(nèi)完成，反應(yīng)方程式如圖2所示。由于試劑具有揮發(fā)性，所以需用過(guò)量試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后剩余試劑通過(guò)減壓蒸餾去除，再進(jìn)行色譜分開(kāi)。

HPLC的使用之一

FMOC–Cl能同時(shí)與一級(jí)和二級(jí)氨基酸反應(yīng)，反應(yīng)迅速，可在30s內(nèi)完成；衍生產(chǎn)物需迅速用戊烷萃取，萃取所得化合物穩(wěn)定，在室溫可穩(wěn)定保存13d。試劑本身及其水解產(chǎn)物（FMOC–OH）有熒光，對(duì)色譜分開(kāi)會(huì)產(chǎn)生一定干擾；與組氨酸形成衍生物不穩(wěn)定，影響定量。

3.46–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亞胺基甲酸酯

6–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亞胺基甲酸酯（6–aminoquinolyl–N–hydroxy–succinimidylcarbamate，簡(jiǎn)稱AQC），是一種較新柱前衍生試劑，也是近年應(yīng)用較為廣泛氨基酸柱前衍生試劑之一。AQC與氨基酸反應(yīng)迅速，反應(yīng)方程式如圖4所示。衍生產(chǎn)物既可用紫外檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；也可用熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm。

到最大產(chǎn)率。衍生產(chǎn)物熒光易因緩沖液淬滅，衍生產(chǎn)物不太穩(wěn)定，需在密閉和避光條件下反應(yīng)，且衍生完成后需馬上進(jìn)樣分析，易生成多級(jí)衍生物；如組氨酸與Dansyl–Cl反應(yīng)產(chǎn)物易形成雙峰，重復(fù)性較差。3.6鄰苯二甲醛

鄰苯二甲醛（o–phthaldialdelhyde，簡(jiǎn)稱OPA），能在還原劑巰基乙醇存在下與一級(jí)氨基酸反應(yīng)生成具有很強(qiáng)熒光異吲哚衍生產(chǎn)物，反應(yīng)迅速，在室溫下1min即可完成，反應(yīng)產(chǎn)物激發(fā)波長(zhǎng)350~360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm，具體反應(yīng)方程式如圖6所示。

OPA衍生氨基酸反應(yīng)特點(diǎn)如下：

優(yōu)點(diǎn)：OPA本身不發(fā)熒光，色譜分開(kāi)中不會(huì)形成干擾峰；OPA與硫醇試劑聯(lián)用和一級(jí)氨基酸反應(yīng)迅速，易于實(shí)現(xiàn)在線自動(dòng)化。儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，普通試驗(yàn)

AQC可同時(shí)與一、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短；且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，定量確鑿；衍生緩沖液適用范圍寬，一般為8.2~9.7；但衍生試劑水解產(chǎn)物影響分開(kāi)。此外，當(dāng)樣品中存在羥基脯氨酸和羥基賴氨酸時(shí)，反應(yīng)副產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重干擾定量〔25~26〕。3.5丹磺酰氯

丹磺酰氯（Dansyl–Cl），也是近年常用氨基酸熒光衍生試劑之一。尋常Dansyl–Cl與氨基酸反應(yīng)，形成單酞化衍生物具有很強(qiáng)熒光，反應(yīng)方程式如圖5所示。衍生產(chǎn)物激發(fā)波長(zhǎng)330nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm，也可用紫外檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。

室均可滿足要求；衍生產(chǎn)物對(duì)柱損耗小。

缺點(diǎn)：OPA不能直接與二級(jí)氨基酸（脯氨酸和羥基脯氨酸）反應(yīng)，需預(yù)先在NaClO等氧化劑作用下氧化開(kāi)環(huán)，也可通過(guò)與FMOC–Cl聯(lián)用方法衍生二級(jí)氨基酸。OPA與氨基酸衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，衍生后需馬上進(jìn)樣分析；胱氨酸衍生產(chǎn)物產(chǎn)量很低而不能被檢出。3.72，4–二硝基氟苯

2，4–二硝基氟苯（2，4–dinitro–fluorobenzene，簡(jiǎn)稱DNFB），在避光、60℃條件下，能與一、二級(jí)氨基酸同時(shí)反應(yīng)生成一種穩(wěn)定衍生產(chǎn)