蛋白酶的測(cè)定方法課件

響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶生產(chǎn)工藝（下）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、干物質(zhì)失重的測(cè)定2、蛋白酶活力的測(cè)定3、數(shù)據(jù)分析與建模4、響應(yīng)曲面作圖5、整改方案分析一、干物質(zhì)失重的測(cè)定干重失重＝發(fā)酵前干重－發(fā)酵后干重1、原理

（1）、福林試劑在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酚類(lèi)化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。（2）、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)。（3）、以酪蛋白為底物，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加三氯醋酸，終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開(kāi)，經(jīng)過(guò)濾后取濾液。用碳酸鈉堿化，再加入福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。（4）、藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。2試劑1福林試劑于2000ml磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，濃鹽酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸鋰(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再煮沸l(wèi)5min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至1000ml。過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋?zhuān)闯上♂尩母Ａ衷噭?、2%酪蛋白溶液稱(chēng)取干酪素2g加入0.1mol/L氫氧化鈉20ml在水浴中加熱使溶解(必要時(shí)用小火加熱煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液定容至1000ml即成。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。否則極易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)。配制酪蛋白溶液定容時(shí)，若泡沫過(guò)多，則可加1~2滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸2~3滴濕潤(rùn)。6、100μg/m1酪氨酸溶液精確稱(chēng)取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L鹽酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其濃度為1000μg/m1。再吸取此液10ml以蒸餾水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液

(2)測(cè)定步驟另取6支試管按上表編號(hào)分別吸取不同濃度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸鈉5m1，再加入已稀釋的福林試劑1m1。搖勻置于水浴鍋中，40℃保溫發(fā)色20min，在波長(zhǎng)660nm處測(cè)定吸光度。一般測(cè)3次，取平均值．以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱(chēng)取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲2g，用10－20ml蒸餾水，30℃浸提半小時(shí)，用濾紙過(guò)濾。將濾液稀釋一定倍數(shù)(使其測(cè)定光密度在0.2－0.4范圍內(nèi)為宜)。3.2酶液的制備

蛋白酶活力單位定義：在40℃，pH2.5下，每分鐘水解酪蛋白釋放1微克酪氨酸的酶量定義為1個(gè)蛋白酶單位。式中：K：標(biāo)準(zhǔn)曲線中O·D值為1所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)；OD：平行試驗(yàn)管的平均光密度；4：試管中反應(yīng)液總體積(毫升)；10：反應(yīng)10分鐘；N：稀釋倍數(shù)；W：曲的稱(chēng)取量(克)4計(jì)算（1）對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林-酚試劑，其工作曲線K值可以沿用，當(dāng)另配福林-酚試劑時(shí)，工作曲線應(yīng)重作。（2）當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)，其結(jié)果會(huì)有差異，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白的生產(chǎn)廠。5說(shuō)明三、數(shù)據(jù)分析與建模使用DESIGNEXPERT7.1軟