第六章真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)

第六章真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)第1頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素第2頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二大腸桿菌表達(dá)體系克隆基因正確表達(dá)的基本條件克隆基因表達(dá)活性的檢測第3頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

1.對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；

全基因組測序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架

2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；

3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；

4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。優(yōu)越性：大腸桿菌表達(dá)體系第4頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。

2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核的不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號功能的核苷酸序列。

3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌中表達(dá)體系的不足第5頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。大腸桿菌表達(dá)體系第6頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有關(guān)。

重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。

克隆基因正確表達(dá)的基本條件第7頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動子；插入序列的正確取向?？寺』蛘_表達(dá)的基本條件第8頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二1.微細(xì)胞檢測法；2.巨細(xì)胞檢測法；3.偶聯(lián)反應(yīng)測定法?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測第9頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

這是一種適于檢測質(zhì)?；虮磉_(dá)的體內(nèi)檢測法。微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長期間連續(xù)產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞。微細(xì)胞檢測法克隆基因表達(dá)活性的檢測第10頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達(dá)狀況的理想體系?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測第11頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二Example:

ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）,

在微細(xì)胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時(shí)，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測第12頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二巨細(xì)胞檢測法

1.經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌recAuvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線照射后6小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線照射后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時(shí)合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測第13頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二2.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線照射使DNA受到了損傷，自身基因的表達(dá)受到了嚴(yán)重的抑制。通過同λ噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測第14頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二偶聯(lián)反應(yīng)測定法

使DNA模板在細(xì)菌無細(xì)胞體系中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄－轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體基因組上的外源片斷進(jìn)行體外表達(dá)，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個(gè)小片段指導(dǎo)合成的。

克隆基因表達(dá)活性的檢測第15頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

優(yōu)點(diǎn)：

1.放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個(gè)系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時(shí)后可被迅速檢出；

2.應(yīng)用這個(gè)體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達(dá)。go第16頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二大腸桿菌表達(dá)載體第17頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點(diǎn)組成部分第18頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

最佳啟動子具備的條件第一必須是啟動子能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上

1.啟動子第19頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第二這個(gè)啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)樵诒磉_(dá)毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件第三這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。（IPTG）第20頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二乳糖啟動子Plac的可控性

野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高PO基地水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白乳糖異丙基β－D硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)高效轉(zhuǎn)錄PO第21頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二乳糖啟動子Plac的可控性野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結(jié)合啟動子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5cAMPCAP高效轉(zhuǎn)錄Placo葡萄糖代謝cAMP濃度降低Placo基底水平轉(zhuǎn)錄PlacUV5o高效轉(zhuǎn)錄第22頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

啟動子封堵作用：由一個(gè)上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動子時(shí)，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個(gè)啟動子的功能活性抑制另一個(gè)啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動子封堵作用。轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。2.轉(zhuǎn)錄終止子第23頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性：

外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：第24頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率第25頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tφ。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選強(qiáng)終止子的選擇與使用篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子第26頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二3.核糖體結(jié)合位點(diǎn)

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）第27頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列第28頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二4.轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率。5.轉(zhuǎn)譯終止子

mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。大腸桿菌格外偏愛使用終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。第29頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA，接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質(zhì)粒載體重組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求使克隆的片斷恰好插入在緊鄰報(bào)告基因的上游位置隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報(bào)告基因的表達(dá)活性。功能啟動子的分離：1.一般程序：第30頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

報(bào)告基因（reportergene）：

特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)第31頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二利用CAT基因進(jìn)行功能啟動子的分離和活性測定2.無啟動子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建Ecoli基因文庫細(xì)胞裂解物、14C標(biāo)記得氯霉素乙酰輔酶A薄層層析放射自顯影CAT活性的檢測：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化氯霉素（2-或3-）發(fā)生乙?；饔?。第32頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二3.使用tetr作報(bào)告基因分離功能啟動子

1.首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個(gè)tet基因、Hind位點(diǎn)）上的tet的啟動子序列中插入一個(gè)EcoR1的酶切位點(diǎn)（pBRH3B,pBRH1），使之失活。

2.將純化的細(xì)菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或pBRH1的EcoR1限制性位點(diǎn)上；轉(zhuǎn)化給對tet敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。第33頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第34頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二4.使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功能啟動子

能夠檢測啟動子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來源于pBR322第35頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK第36頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸集團(tuán)給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強(qiáng)度，可推算報(bào)告基因（galK）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。第37頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二分離功能的啟動子：將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的MCS區(qū)的單克隆位點(diǎn)上；將體外連接的DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具GalE＋、GalK－的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。第39頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動子探針質(zhì)粒pKO1上受體細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動子活性的重組克隆啟動子的篩選第40頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素

1.選用的報(bào)告基因galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測的蛋白質(zhì)（鑒定啟動子表達(dá)活性的強(qiáng)弱）；

2.應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動子）。

3.采用半乳糖激酶缺陷型的大腸桿菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK－）作轉(zhuǎn)化受體；第41頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二5.啟動子的構(gòu)建Ptac=3Ptrp=11Plac第42頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

1.Lac啟動子的表達(dá)載體

2.Trp啟動子的表達(dá)載體

3.PL啟動子的表達(dá)載體常用的大腸桿菌表達(dá)載體第43頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第44頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。這類表達(dá)載體的最突出的特點(diǎn)是，含有一條足夠大的編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個(gè)克隆的外源DNA片斷插入到這個(gè)啟動子之后，人保持著lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí)，這個(gè)重組質(zhì)粒就會合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。第45頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二1.經(jīng)過Hae切割的203bp的酶切片斷上具有Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、CAP作用區(qū)以及RNA聚合酶作用區(qū)、β-半乳糖苷酶的頭8個(gè)密碼子。有一些對阻遏物作用不敏感的啟動子，也被用來制備表達(dá)載體2.95bp的Alu片斷：不完整的CAP結(jié)合序列3.L8突變的203bp區(qū)段，在CAP結(jié)合序列里發(fā)生了G-A的轉(zhuǎn)換4.在uv5突變，使lac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（RNA聚合酶結(jié)合區(qū)T-A顛換,相鄰堿基G-A的轉(zhuǎn)換）第46頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒的構(gòu)建：將含有l(wèi)ac啟動子的Hae酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng)EcoR1切割并對其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的pBR322質(zhì)粒上。第47頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二增加2個(gè)堿基對第48頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第49頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二2.Trp啟動子的表達(dá)載體這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于lac啟動子表達(dá)載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。第50頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二構(gòu)建：

1.大腸桿菌染色體DNA的5.4kbHind片斷，含有trp啟動子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。

2.將此片斷，克隆到pBR322質(zhì)粒的Hind位點(diǎn)，構(gòu)建成了ptrpED3表達(dá)載體（含有兩個(gè)Hind位點(diǎn)）。

3.Hind部分酶切消化，將靠近EcoR1位點(diǎn)的一個(gè)Hind位點(diǎn)，經(jīng)核酸外切酶和S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED5-1.

第51頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第52頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)粒的Hinf1片斷克隆到了pBR322質(zhì)粒的Hind位點(diǎn)上，形成重組質(zhì)粒pWT111（含有trp調(diào)節(jié)序列和trpE基因的頭7個(gè)密碼子）。第53頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第54頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二Trp啟動子表達(dá)載體已用來生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素三啟動子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動子單元第55頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二3.PL啟動子的表達(dá)載體是一種最廣泛使用大腸桿菌表達(dá)載體的啟動子之一。

第56頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)第57頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。

42度時(shí)，阻遏蛋白失活；

28-30度時(shí)，PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制通過改變溫度來控制PL啟動子的開閉第58頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二pPLc24表達(dá)載體：用來表達(dá)天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體含有MS2-聚合酶基因開始的98個(gè)密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind單切點(diǎn)。EcoR單切點(diǎn)靠近λPL啟動子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。第59頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第60頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二pPLa2311表達(dá)載體可以控制具有轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的外源片斷插入基因的表達(dá)。這種啟動子可接受熱敏感的λ阻遏蛋白質(zhì)的抑制。

第61頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二組成：

1.pBR322的Hae－EcoR片斷；編碼ampr2.λ噬菌體的Hae-Hae片斷：λPL3.pMK20質(zhì)粒的Hae片斷：編碼kanr4.具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)的Hae片斷：經(jīng)pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來。第62頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二第63頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二pPLc2833表達(dá)載體調(diào)節(jié)型強(qiáng)啟動子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達(dá)

第64頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二組成：

1.一個(gè)調(diào)節(jié)型的強(qiáng)啟動子；

2.一個(gè)用作選擇記號的氨芐青霉素抗性基因ampr；

3.一個(gè)直接位于PL啟動子下游的多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)第65頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)取代pPLc2833質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)，由此形成的新質(zhì)粒pCP3。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。（42度，拷貝數(shù)提高5～10倍）go第66頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)第67頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位融合蛋白質(zhì)的表達(dá)第68頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2.周質(zhì)中表達(dá)3.胞外表達(dá)1.外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位第69頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):

外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體（InclusionBodies，IB）包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分第70頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：1.形成包涵體

a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離

b.蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用

c.蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會使寄主細(xì)胞受傷害第71頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高

二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。3.表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單。第72頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二缺點(diǎn)：

1.包涵體

a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復(fù)其生物學(xué)活性

b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低

c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴

2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）

第73頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二3.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實(shí)性受影響4.蛋白質(zhì)會被酶解5.蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜第74頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二周質(zhì)中表達(dá)：

周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。

第75頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：

1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡單

2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重

3.促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）

第76頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，在體內(nèi)對信號肽進(jìn)行切割

相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去4.蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實(shí)第77頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制

原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感第78頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二缺點(diǎn)：

1.信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)

2.有可能形成包涵體第79頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二胞外表達(dá)：

使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化第80頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二途徑：

1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）

2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）第81頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：

1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低

目的蛋白穩(wěn)定性高，重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍

2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化

3.增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用

第82頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二缺點(diǎn)：

1.在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會分泌到胞外培養(yǎng)基中去的

2.由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過程比較復(fù)雜第83頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二2.融合蛋白質(zhì)的表達(dá)

除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白第84頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二一、由報(bào)告基因的編碼序列區(qū)和另一個(gè)基因的啟動子及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成的二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成由DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型第85頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因第86頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二

融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：1.化學(xué)斷裂法2.酶促裂解法第87頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)斷裂法

用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法第88頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二酶促裂解法：單殘基位點(diǎn)

蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的第89頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二多殘基位點(diǎn)

為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物第90頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二go第91頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二影響克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率因素第92頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二5’-UTR對克隆基因表達(dá)效率的影響

a.啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響

大腸桿菌啟動子的保守序－35區(qū)（5’TTGACA）和－10(5’TATAAT)區(qū);它們之間的距離(17bp)b.啟動子與克隆基因的間隔距離對表達(dá)效率的影響

當(dāng)mRNA分子5’－末端與SD序列之間的長度小于15bp時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率下

第93頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二2.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對基因表達(dá)效率的影響

a.質(zhì)粒載體點(diǎn)的拷貝數(shù)對表達(dá)效率的影響

b.質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響第94頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對細(xì)菌生長代謝的影響

目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道第95頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP33擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在4422℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)第96頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二3.mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對基因表達(dá)效率的影響

a.轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響

b.mRNA的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響第97頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響：

一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低第98頁，共106頁，2023年，2月20日，星期二SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、