細(xì)胞生物學(xué)第十三章

細(xì)胞生物學(xué)第十三章第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞衰老的分子機(jī)理第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二一、Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限 ◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞◆細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)◆物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系 ●二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞來源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？◆衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長;◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細(xì)胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢.第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二三、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞核的變化●內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線粒體的變化:通常，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大●致密體的生成:由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來●膜系統(tǒng)的變化第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞核的變化◆體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大◆細(xì)胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、染色質(zhì)固縮化

第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二膜系統(tǒng)的變化◆衰老的細(xì)胞，其膜流動性降低、韌性減小◆衰老細(xì)胞間間隙連接減少;

細(xì)胞膜P面顆粒的在年老細(xì)胞中明顯減少，E面顆粒相對增加。第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二四、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理●氧化性損傷學(xué)說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS---O2-，OH-

，

H2O2

），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。

●端粒與衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990）每次細(xì)胞分裂后，端?？s短●

rDNA與衰老:酵母染色體外rDNA

環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老?！癯聊畔⒄{(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（Sircomplex）與衰老：Sircomplex存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點(diǎn)DNA轉(zhuǎn)錄。核仁的沉默化與壽命延長有關(guān)●

SGS1基因和WRN基因與衰老：SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;

酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突變引發(fā)早老癥.●

發(fā)育程序與衰老:線蟲幼蟲遇不良環(huán)境后，進(jìn)入一個特殊長期的持續(xù)幼蟲的階段●

線粒體DNA與衰老:mtDNA突變積累與細(xì)胞衰老有關(guān).

第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●概念：細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。 ●生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用：蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡，

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，

發(fā)育過程中手和足的成形過程。第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的生化特征●誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子●細(xì)胞凋亡的檢測第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)●細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptoticbodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。整個過程中，細(xì)胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)?！窦?xì)胞壞死時，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體 ◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡的生化特征◆細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為

180～200bp特征性的DNAladders梯狀條帶 ◆凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）積累并達(dá) 到較高水平第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA

和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡的檢測◆形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法◆彗星電泳法（cometassay）單個細(xì)胞－－懸?。呀猓娪荆瓱晒馊旧{(diào)亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形?！袅魇郊?xì)胞分析根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA

產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理

●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡 ●Bcl-2家族

細(xì)胞調(diào)亡的信號傳導(dǎo)第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑·凋亡信號通路當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;

裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS(磷脂酰絲氨酸)重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二Bcl-2家族◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3

第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡◆當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡在小鼠足趾形成中的作用（a）開始時足趾是相連在一起的；（b）經(jīng)編程死亡足趾分開。第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二caspase超家族成員及其相應(yīng)底物第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二BCL-2家族成員第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞外信號如果細(xì)胞外的信號促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡，則屬于死亡的正控制。若細(xì)胞外信號抑制細(xì)胞的程序性死亡，則是死亡的負(fù)控制，將這種信號稱為存活因子(survivalfactors)。目前對存活因子是如何作用的，基本不了解。促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的例子很多，也研究得較為清楚。左圖顯示了細(xì)胞外信號——腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）激發(fā)細(xì)胞的程序性死亡的過程。受體介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡途徑第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）激發(fā)細(xì)胞的程序性死亡的過程就是細(xì)胞外信號對程序性死亡的正控作用。TNF是一種能夠殺死腫瘤的因子，它是由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞合成的。TNF的受體TNFR1是介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的死亡受體(deathreceptor)家族的成員，是由三個亞基裝配而成的膜蛋白。受體的每一個亞基都含有一段由70～80個氨基酸殘基組成的跨膜死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain)。TNF與受體結(jié)合，引起受體死亡結(jié)構(gòu)域構(gòu)型的改變，招募了許多細(xì)胞質(zhì)蛋白與之結(jié)合，如FADD（Fas-associateddeathdomain）、TRADD（TNFreceptor-associateddeathdomain）和前體caspase-8,這些蛋白都具有死亡結(jié)構(gòu)域。在前體caspase-8相互結(jié)合前，它們的酶活性很低，但當(dāng)兩個或多個前體caspase相互結(jié)合在一起時就進(jìn)行相互切割并被激活。最后激活的起始caspase-8含有四條多肽鏈，是由兩個前體切割后裝配而成的。激活的起始caspase-8作用于執(zhí)行前體caspase，并將之激活，引起細(xì)胞的程序性死亡。第36頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞內(nèi)信號除了外部信號激發(fā)程序性細(xì)胞死亡外，細(xì)胞內(nèi)源信號也會激發(fā)細(xì)胞的程序性死亡，包括：DNA損傷、細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度過高、極度氧脅迫（產(chǎn)生大量的自由基）等。在內(nèi)源信號中有些是促進(jìn)細(xì)胞死亡的正控制信號，如細(xì)胞色素c,凋亡蛋白酶激活因子（apoptoticprotease-activatingfactor，Apaf）。內(nèi)源信號中也有抑制細(xì)胞死亡的負(fù)控制信號，如哺乳動物中的Bcl-2蛋白(Bcl-2protein)和Bcl-x蛋白。下圖是細(xì)胞內(nèi)源信號激發(fā)細(xì)胞程序性死亡的過程。第37頁，共40頁，2023年，2月20日，星期二由于細(xì)胞內(nèi)的損傷等信號激活了Bcl-2家族中的促凋亡前體蛋白，如Bda或Bax,使它們從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到線粒體外膜(插入到外膜中)，使線粒體外膜的通透性發(fā)生改變，使原本松散結(jié)合于線粒體內(nèi)膜外表面的細(xì)胞色素c從線粒體膜間隙進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。在不到5分鐘的時間內(nèi)，細(xì)胞色素c全部從凋亡的線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠，因此推測細(xì)胞色素c（以及隨細(xì)胞色素c一起釋放到胞質(zhì)溶膠的某些線粒體膜間隙的基礎(chǔ)蛋白）是傳遞細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號