理學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)

理學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)第1頁(yè)/共103頁(yè)第一節(jié)PCR技術(shù)原理第2頁(yè)/共103頁(yè)一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)第3頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物第4頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶第5頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……第6頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第7頁(yè)/共103頁(yè)KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第8頁(yè)/共103頁(yè)國(guó)內(nèi)復(fù)旦大學(xué)1988年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬立人教授等在1989年研制成功了PCR自動(dòng)裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC51A/B型DNA熱循環(huán)儀體積小，造型美觀，價(jià)格適宜，操作簡(jiǎn)單，尤為適宜國(guó)內(nèi)應(yīng)用。第9頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR發(fā)明不到10年，卻已獲得廣泛應(yīng)用。目前，每年都有上千篇文章發(fā)表。1991年，期刊“PCR方法與應(yīng)用”（PCrMethodsandApplication）在美國(guó)創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。PCR技術(shù)作為一種方法學(xué)革命，必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各有關(guān)學(xué)科的研究，使其達(dá)到一個(gè)新的高度。第10頁(yè)/共103頁(yè)1993年度諾貝爾化學(xué)將已于10月13日揭曉，KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得此殊榮?，F(xiàn)在世界各地都在使用PCR檢測(cè)病人血液中的微量遺傳物質(zhì)，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學(xué)院說(shuō)：“PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中。該方法同DNA測(cè)序法結(jié)合起來(lái)很可能將成為研究動(dòng)植物分類學(xué)的一種革新工具?！币幻幽么蠹?guó)科學(xué)家MichaelSmith因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”的方法而與Mullis同享此榮。第11頁(yè)/共103頁(yè)引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第12頁(yè)/共103頁(yè)Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020第13頁(yè)/共103頁(yè)72℃94℃55℃PCR循環(huán)第14頁(yè)/共103頁(yè)二、PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。第15頁(yè)/共103頁(yè)第16頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；第17頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；第18頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。第19頁(yè)/共103頁(yè)Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。第20頁(yè)/共103頁(yè)TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第21頁(yè)/共103頁(yè)三、PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X緩沖液10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/L第22頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR儀第23頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第24頁(yè)/共103頁(yè)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第25頁(yè)/共103頁(yè)模板DNA95℃第26頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物第27頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第28頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始第29頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第30頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第31頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

第32頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA第33頁(yè)/共103頁(yè)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。四、PCR反應(yīng)體系第34頁(yè)/共103頁(yè)（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第35頁(yè)/共103頁(yè)（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。第36頁(yè)/共103頁(yè)（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第37頁(yè)/共103頁(yè)2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。第38頁(yè)/共103頁(yè)（3）延伸

70-75oC，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加第39頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR產(chǎn)物的積累規(guī)律

在PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。到達(dá)平臺(tái)期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中不可避免。

第40頁(yè)/共103頁(yè)

PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖第41頁(yè)/共103頁(yè)五、PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則①引物長(zhǎng)度一般以18～30bp為宜，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。②避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。第42頁(yè)/共103頁(yè)④要避免兩個(gè)引物間特別是3`末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3`末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。⑤引物3`末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3`末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高。⑥引物5`末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。⑦引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。第43頁(yè)/共103頁(yè)六、PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無(wú)菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分第44頁(yè)/共103頁(yè)第二節(jié)PCR技術(shù)應(yīng)用第45頁(yè)/共103頁(yè)一、PCR技術(shù)的主要類型㈠反向PCR㈥錨定PCR㈡不對(duì)稱PCR㈦原位PCR㈢RT-PCR㈧重組PCR㈣差異顯示PCR㈨免疫PCR㈤實(shí)時(shí)定量PCR㈩多重PCR第46頁(yè)/共103頁(yè)1)反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列第47頁(yè)/共103頁(yè)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第48頁(yè)/共103頁(yè)2）不對(duì)稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究第49頁(yè)/共103頁(yè)

高濃度引物低濃度引物第50頁(yè)/共103頁(yè)3）RT－PCR:是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的PCR反應(yīng),用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)。第51頁(yè)/共103頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增第52頁(yè)/共103頁(yè)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈第53頁(yè)/共103頁(yè)4）多重PCR：在一個(gè)反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物第54頁(yè)/共103頁(yè)5）實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)定量PCR（也稱TaqManPCR,以下簡(jiǎn)稱FQ-PCR）是美國(guó)PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)。第55頁(yè)/共103頁(yè)實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR):通過(guò)特定設(shè)計(jì)的PCR儀器來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實(shí)時(shí)定量PCR。第56頁(yè)/共103頁(yè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:實(shí)時(shí)定量PCR在檢測(cè)過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的熒光信號(hào)的累積來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，故稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。第57頁(yè)/共103頁(yè)原理和方法

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基因FAM（熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（熒光發(fā)射峰值在582nm處），探針的3’端被磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被延伸。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針切斷,淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放出來(lái).模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系,因此用該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。第58頁(yè)/共103頁(yè)第59頁(yè)/共103頁(yè)

實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理第60頁(yè)/共103頁(yè)實(shí)驗(yàn)儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴(kuò)增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應(yīng)型反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后,通過(guò)電腦分析,可直接給出定量結(jié)果。如果用其他PCR儀,則需要同時(shí)使用熒光探測(cè)儀測(cè)量反應(yīng)管中的熒光信號(hào),計(jì)算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發(fā)射基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度與淬滅基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的比率,RQ-代表空白管中二者的比率,△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過(guò)程中熒光信號(hào)變化量，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。第61頁(yè)/共103頁(yè)由于熒光探針的引入，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件：①探針長(zhǎng)度應(yīng)在20～40個(gè)堿基左右，保證結(jié)合特異性。②GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。第62頁(yè)/共103頁(yè)

特點(diǎn)

FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過(guò)光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。FQ-PCR只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過(guò)程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。第63頁(yè)/共103頁(yè)

1病原體測(cè)定由于PCR技術(shù)的問(wèn)世，使得病原體檢測(cè)能夠快速而方便的進(jìn)行。但由于其高靈敏性，實(shí)驗(yàn)操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽(yáng)性結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義，因此模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問(wèn)題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測(cè)研究。Morris等用FQ-PCR對(duì)黑猩猩丙型肝炎動(dòng)物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進(jìn)行了研究。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時(shí)又能提高效率，因此可作為一種檢測(cè)HCV的有效方法。同時(shí)，由于FQ-PCR可以測(cè)出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。第64頁(yè)/共103頁(yè)

以前常規(guī)檢測(cè)大腸桿菌的方法，都因?yàn)榉爆崳枰罅康腜CR后處理過(guò)程及不能對(duì)標(biāo)本定量而受到限制。美國(guó)Witham等1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測(cè)研究。針對(duì)不同血清變異型的大腸桿菌，他們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用不同的探針，從而提高了實(shí)驗(yàn)特異性。他們同時(shí)還對(duì)探針相對(duì)于引物的位置、反應(yīng)液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實(shí)驗(yàn)的因素進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測(cè)量96管樣品，還可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，又不需要進(jìn)行電泳及EB染色后處理過(guò)程，實(shí)際應(yīng)用方便，從而提高了實(shí)驗(yàn)的參考價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。因此該實(shí)驗(yàn)方法是食品檢測(cè)方面的一個(gè)突破。第65頁(yè)/共103頁(yè)

2.腫瘤研究

意大利Gelmini等用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閰⒄仗剿髯罴褜?shí)驗(yàn)條件，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在28～31之間時(shí)，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們?cè)诖藯l件下擴(kuò)增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說(shuō)明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Southern印跡結(jié)果和已報(bào)告的競(jìng)爭(zhēng)性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。第66頁(yè)/共103頁(yè)

3.基因表達(dá)研究

由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對(duì)mRNA的檢測(cè)顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。為了探測(cè)骨髓基質(zhì)血小板生成因子（TPO）在巨核細(xì)胞生成過(guò)程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過(guò)程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqManEZRT-PCR試劑盒在ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法測(cè)定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水平明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關(guān)性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表達(dá)水平與巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)也有相關(guān)性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)闡明TPO的作用提供了依據(jù)。第67頁(yè)/共103頁(yè)

4.免疫組份分析

對(duì)免疫T細(xì)胞群體V-β組份進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過(guò)流式細(xì)胞法或RFQ-PCR法來(lái)進(jìn)行。1997年Lang等用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，他們?cè)诜磻?yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對(duì)不同的V-β成份，選用特異的上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行處理，即可獲得各個(gè)成份的數(shù)據(jù)。第68頁(yè)/共103頁(yè)

5.基因突變及多態(tài)性的研究

美國(guó)Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術(shù)對(duì)正常痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究。他們采用一對(duì)可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結(jié)合的引物，并設(shè)計(jì)兩個(gè)有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，順利地把有此單核苷酸差異的兩個(gè)痘病毒株進(jìn)行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。第69頁(yè)/共103頁(yè)

6.其他方面

日本Isono利用FQ-PCR進(jìn)行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)行葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的葉綠體成熟過(guò)程聯(lián)系起來(lái)。1998年美國(guó)Higgins等還建立起一套用熒光探針檢測(cè)鼠疫纖溶酶原激活基因（pla）的實(shí)驗(yàn)方法。第70頁(yè)/共103頁(yè)綜上所述，F(xiàn)Q-PCR作為一種核酸定量技術(shù)，應(yīng)用較多且較成熟的主要是在病原體檢測(cè)方面，其優(yōu)越性在此方面也得以充分體現(xiàn)。因此將該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于臨床，具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面，尤其是基因表達(dá)的研究，該技術(shù)目前應(yīng)用的還較少，在此方面加強(qiáng)研究應(yīng)用，將會(huì)有廣闊的前景。

第71頁(yè)/共103頁(yè)二、PCR技術(shù)應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測(cè)其他……第72頁(yè)/共103頁(yè)第73頁(yè)/共103頁(yè)第74頁(yè)/共103頁(yè)第75頁(yè)/共103頁(yè)第76頁(yè)/共103頁(yè)第77頁(yè)/共103頁(yè)第78頁(yè)/共103頁(yè)第79頁(yè)/共103頁(yè)第80頁(yè)/共103頁(yè)第81頁(yè)/共103頁(yè)第82頁(yè)/共103頁(yè)第83頁(yè)/共103頁(yè)第84頁(yè)/共103頁(yè)第85頁(yè)/共103頁(yè)第86頁(yè)/共103頁(yè)第87頁(yè)/共103頁(yè)第88頁(yè)/共103頁(yè)第89頁(yè)/共103頁(yè)第90頁(yè)/共103頁(yè)第91頁(yè)/共103頁(yè)P(yáng)CR示例一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)。第92頁(yè)/共103頁(yè)1、材料