生物化學試驗基礎(chǔ)

生物化學試驗基礎(chǔ)第1頁/共43頁1

教學目的掌握生物化學的基本知識、基本理論及基本實驗技能；掌握分光光度計的使用、離心技術(shù)、電泳、層析等的原理和操作技能；掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖等重要物質(zhì)的分離、純化和測定技術(shù)的原理及方法；培養(yǎng)分析和解決問題能力以及嚴謹細致的科學作風、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)。

第一節(jié)生物化學實驗緒論第2頁/共43頁2通過生物化學實驗主要做到學習設計或驗證一個試(實)驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學會嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。訓練實驗的動手能力，學會熟練地使用各種生物化學實驗儀器。學會準確翔實地記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠科學、規(guī)范、清潔、整齊地進行所有的實驗。掌握生物化學的各種基本實驗方法和實驗技能，為今后參加科研及技術(shù)工作打下堅實的基礎(chǔ)。第3頁/共43頁3實驗記錄實驗中應及時準確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)。實驗記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個結(jié)果都要盡可能重復觀測二次以上，即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應如實記錄，不得涂改。實驗中要詳細記錄實驗條件，如使用的儀器型號、編號、生產(chǎn)廠家等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、試劑的濃度等。

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1)生物化學實驗不同于化學和生物學實驗，而有其獨特的實驗技能和基本操作。課前必須認真預習，明確實驗目的、原理、操作關(guān)鍵步驟及注意事項。

2)要十分注意實驗安全，未經(jīng)實驗指導老師允許不得開、關(guān)任何電源和儀器設備開關(guān)（按鈕）。

3)實驗時應本著認真、積極的態(tài)度，在教師的指導下完成每次實驗。注意觀察實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并對實驗結(jié)果展開討論。結(jié)果不良時，必須重做。4)實驗中，聽從老師指導，嚴格遵守操作規(guī)程，取用試劑時，應仔細辨明標簽，以免取錯。取完試劑后，應及時將瓶蓋蓋好，放回原處，切忌亂拿亂放，“張冠李戴”。并應及時將實驗結(jié)果和原始數(shù)據(jù)如實記錄在實驗報告上，按時寫出實驗報告。5)實驗后，必須把儀器洗凈放入儀器柜內(nèi)；清掃實驗臺面、地面；試劑瓶要擺放整齊。要經(jīng)常保持實驗室內(nèi)清潔，不亂丟紙屑及所有固體廢棄物。6)自覺遵守課堂紀律，不遲到早退；保持室內(nèi)安靜；不高聲談笑。同學間應互助友愛。4實驗室規(guī)則第5頁/共43頁7)愛護實驗器材，非本次實驗使用的儀器設備未經(jīng)老師允許不得亂動。本次實驗必須使用的儀器設備，在了解儀器性能和操作規(guī)程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或?qū)⒉考С鍪彝?。實驗過程中，如發(fā)現(xiàn)設備損壞或運轉(zhuǎn)異常，應立即報告老師。8)實驗室內(nèi)嚴禁飲、食及吸煙!．對腐蝕性或易燃性試劑，操作時要格外小心。如酒精、乙醚等低沸點有機溶劑，使用時應禁明火，遠離火源，若需加熱要用水浴加熱，不可直接在火上加熱。用吸量管吸取試劑時應使用吸球，嚴禁用嘴吸取。對于有毒、腐蝕的試劑更應注意，應避免其直接接觸人體及衣物。乙醚、丙酮等易燃試劑應遠離火源，以免發(fā)生意外。9)注意實驗室衛(wèi)生、整潔。廢棄液體應倒入水槽，放水沖走，有毒廢棄物應放入廢物缸并及時作無害化處理,實驗用過的棉花、廢紙、沉淀廢渣及其他廢棄物品等均應放入指定容器，不得隨意亂扔或丟進水槽。10)每次實驗課由學生輪流值日。值日生要負責打掃實驗室的衛(wèi)生，整理實驗室。檢查水、電，關(guān)好門窗，經(jīng)老師檢查后，方可離開實驗室。4實驗室規(guī)則第6頁/共43頁5實驗須知實驗前應作好預習，認真閱讀實驗指導。明確實驗目標，能簡述實驗內(nèi)容及主要的操作步驟。實驗過程中，應根據(jù)實驗指導及老師的要求，認真操作，細心觀察，如實記錄。嚴禁捏造實驗數(shù)據(jù)，提倡實事求是的科學態(tài)度，實驗做錯應要求重做，反對弄虛作假。實驗結(jié)束后，要認真書寫實驗報告，及時交老師批閱。第7頁/共43頁6實驗報告實驗報告包括如下內(nèi)容：實驗項目(實驗題目）;實驗目的;實驗原理;實驗器材;主要操作步驟;實驗結(jié)果;問題分析與討論等。第8頁/共43頁第二節(jié)紫外-可見

分光光度計的使用原理和方法

紫外-可見吸收光譜朗伯-比耳定律紫外-可見分光光度計分析條件的選擇測定方法第9頁/共43頁目視比色法回顧比較溶液顏色深淺，從而確定被測定組分含量的方法，稱為目視比色法。目視比色法的準確度和精密度受視力條件影響很大，一般相對誤差約在5％～20％的范圍。第10頁/共43頁常用的目視比色法

最常用的目視比色法是標準系列法:

取一套比色管，于各管中分別加入一系列不同體積的標準溶液，在測定條件下進行顯色定容。此時一系列標準溶液的管中顯出由淺到深的色階。被測溶液在同一條件下顯色:

將被測溶液管與標準系列進行比較，若與其中某一管顏色相同可認為被測溶液濃度與此管濃度相等，若被測溶液顏色介于兩標準顏色之間，可認為被測溶液濃度等于兩管濃度的平均值。第11頁/共43頁常用的目視比色法標準系列未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高第12頁/共43頁1)紫外-可見分光光度法(UV-VIS)

按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。

它是利用物質(zhì)的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質(zhì)進行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析,所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。2.1紫外-可見吸收光譜第13頁/共43頁紫外光：遠紫外光（10-200nm）和近紫外光（200-400nm）的電磁輻射?？梢姽猓?00-800nm的電磁輻射。溶液中物質(zhì)選擇性的吸收可見光中某種顏色的光，溶液就會呈現(xiàn)出一定的顏色。比色分析法：比較有色物質(zhì)溶液顏色深淺來確定物質(zhì)含量的方法。

分光光度法：使用分光光度計進行吸收光譜分析的方法。第14頁/共43頁2)紫外-可見分光光度法的特點：

(1)與其它光譜分析方法相比，其儀器設備和操作都比較簡單，費用少，分析速度快;(2)靈敏度高;(3)

選擇性好;(4)精密度和準確度較高;(5)用途廣泛。

第15頁/共43頁3)紫外-可見吸收光譜物質(zhì)對光的選擇性吸收

物質(zhì)對光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)。第16頁/共43頁

通過測定被測物質(zhì)對不同波長的光的吸收強度（吸光度），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線。在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長λmax進行物質(zhì)含量的測定。

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吸收光譜（吸收曲線）：不同波長光對樣品作用不同，吸收強度不同以λ~A作圖吸收光譜特征：定性依據(jù)吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

第18頁/共43頁圖示第19頁/共43頁吸收曲線的討論：（1）一種吸光物質(zhì)對不同波長的光吸收程度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax

。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。（2）同一種物質(zhì)濃度不同，其吸收曲線形狀相似λmax不變。在λmax處，吸光度A正比于濃度C測定最靈敏（3）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。第20頁/共43頁4)影響紫外-可見吸收光譜的因素

物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等可能發(fā)生變化。溫度在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。第21頁/共43頁溶劑

注意如下幾點：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。第22頁/共43頁5)紫外-可見吸收光譜的應用

紫外-可見吸收光譜除主要可用于物質(zhì)的定量分析外，還可以用于物質(zhì)的定性分析、純度鑒定。第23頁/共43頁2.2朗伯-比爾定律

設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia，透射光強度為It，則

I0=Ia+It吸光度和透光度第24頁/共43頁溶液的吸光定律透光率（透射比）Transmittance透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It第25頁/共43頁吸光度:

為透光度倒數(shù)的對數(shù)，用A表示A=lg1/T=-lgT=lgI0/It透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之比，用T表示：即T=It/I0第26頁/共43頁朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即

A=kcl

式中比例常數(shù)k(吸光系數(shù))與吸光物質(zhì)的本性、入射光波長(單色光純度)及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。

朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)。第27頁/共43頁偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。實際樣品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可使吸光質(zhì)點的吸光特性變化大。第28頁/共43頁2.3紫外-可見分光光度計基本結(jié)構(gòu):光源→單色器→吸收池→檢測器→信號顯示系統(tǒng)

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樣品第29頁/共43頁光源單色器吸收池檢測器信號顯示系統(tǒng)

組成部件第30頁/共43頁第31頁/共43頁0.575光源單色器檢測器顯示主要部件第32頁/共43頁光源：

用于提供足夠強度和穩(wěn)定的連續(xù)光譜。分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。

熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈,鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在350~2500nm；

氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。它們可在180~400nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。

在紫外光區(qū)只能用石英比色皿。紫外—可見分光光度計通常都配有可見和紫外兩種光源。第33頁/共43頁光源：提供符合要求的入射光。要求：在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。紫外光源---氘燈(180-400nm)(氣體放電光源)可見光源---鎢燈(350-2500nm)(熱輻射光源)

光源第34頁/共43頁氘燈氫燈鎢燈第35頁/共43頁

單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。

2單色器

單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。

單色器的作用從波長范圍較寬的入射光線中，過濾分出波段較窄的單色光第36頁/共43頁

吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。

3吸收池

吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應一致）第37頁/共43頁4檢測器

檢測器的作用是檢測光信號，將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒂枰苑糯蟆，F(xiàn)今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器