微生物學課件

第七章

微生物的遺傳和變異1掌握微生物遺傳、變異的物質(zhì)基礎掌握基因突變、基因重組的機制和方式熟悉菌種選育和保藏的基本理論、方法熟悉質(zhì)粒的基本特征及醫(yī)學上重要的質(zhì)粒本章要求2遺傳（heredity）—親代將遺傳信息傳遞給子代，使子代獲得與親代相似的性狀（形態(tài)、結構、代謝、毒力等）變異（variation）—子代與親代相比，性狀發(fā)生改變遺傳是相對的，變異是絕對的—適應新環(huán)境3第一節(jié)微生物的變異現(xiàn)象菌體形態(tài)、結構變異毒力變異菌落形態(tài)變異酶活力的變異5菌體形態(tài)結構變異

青霉素、溶菌酶

正常形態(tài)細菌──────→L型變異

(部分或完全失去胞壁)

正?；魜y弧菌霍亂弧菌L型6毒力變異

β-溫和噬菌體

白喉棒狀桿菌────→獲得白喉毒素7菌落變異

光滑型菌落─────→粗糙型菌落

S

R

失去LPS的特異性多糖重復單位誘導酶的形成eg：與乳糖代謝有關的酶在陳舊培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)或在有免疫力的人體內(nèi)酶活力變異8轉化（transformation）實驗

10活R菌加S菌的DNA加S菌的DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA及DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白質(zhì)加S菌的莢膜多糖長出S菌只長R菌證明轉化因子是DNA的細菌實驗112、感染3、兩種沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，均可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體證明噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA（三）TMV病毒粒子的重建實驗TMV：植物病毒，ssRNA32P－phageE.coli（正常培養(yǎng)基）離心沉淀中有放射性

35S－phageE.coli

E.coli

離心上清液中有放射性吸附使蛋白質(zhì)外殼與E.coli分離外殼吸附131、TMV因為RNA是裸露的，所以感染頻率較低2、HRV霍氏車前花葉病毒花葉癥狀TMVTMVHRV花葉花葉HRVTMV拆開重建感染分離純化苯酚振蕩感染煙草分離純化所以，遺傳物質(zhì)是核酸，而非蛋白質(zhì)14二、微生物的遺傳物質(zhì)（一）真核微生物的遺傳物質(zhì)化學組成：線狀dsDNA和蛋白質(zhì)（sp：組蛋白）存在形式：染色質(zhì)（分裂間期）；染色體（分裂期）結構單位：核小體（200bp的DNA和5種組蛋白組成）（二）原核生物的遺傳物質(zhì)細菌、放線菌

DNA實質(zhì)是一條雙鏈、高度折疊盤繞的大分子（三）病毒和噬菌體的遺傳物質(zhì)除朊病毒外，已知的均為裸露的DNA或RNA（ds、ss）15（三）醫(yī)學上重要的質(zhì)粒1、F因子（致育因子fertility)編碼細菌性菌毛，有F因子的為F＋菌株，可通過接合的方式轉移2、R質(zhì)粒（抗藥質(zhì)粒）編碼細菌對抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性。分類：根據(jù)能否借接合而轉移分1）接合型耐藥質(zhì)?？顾帥Q定因子（r-det）：決定耐藥性，可同時攜帶多種抗藥基因抗藥轉移因子（RTF）：決定轉移性

2）非接合型耐藥質(zhì)粒（r因子）：只有抗藥決定因子（r-det）17耐藥機制：

1）產(chǎn)生頓挫酶破壞抗菌作用的酶eg：β－內(nèi)酰胺酶，可水解β－內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺環(huán)—抗生素失活2）改變細胞膜通透性使藥物無法進入細胞內(nèi)而無法發(fā)揮作用3）改變藥物的原始作用點eg：R因子使細菌核糖體30S亞基發(fā)生變化，鏈霉素不能與之結合，因此不能發(fā)揮抗菌作用3、Col質(zhì)粒編碼大腸菌素（colicin）的質(zhì)粒大腸菌素（colicin）:是一類可使沒有Col質(zhì)粒的而親緣關系密切的菌株死亡的蛋白質(zhì)4、V質(zhì)粒：編碼腸道細菌毒力18第三節(jié)基因突變一、基因突變的概念突變（mutation）：DNA結構（種類、排列方式）的改變，導致其控制的性狀發(fā)生改變突變體（mutant）：具有突變型的細胞或個體二、基因突變的來源根據(jù)引起突變的原因分1、自發(fā)突變（sportaneousmutation）在外界自然條件下發(fā)生的DNA結構改變。突變率：10-9～10-6包括基因突變：又稱為點突變，指DNA局部結構發(fā)生改變?nèi)旧w畸變：大段DNA結構發(fā)生改變，常導致菌體死亡自發(fā)突變誘發(fā)突變19按誘變劑是直接還是間接引起置換，分別討論置換機制1、直接引起置換的誘變劑eg：亞硝酸、羥胺、烷化劑（部分可引起顛換）以亞硝酸為例說明誘變機制：亞硝酸可使堿基發(fā)生氧化脫氨作用，結果AH，CUH烯醇式：與C配對酮式：與T配對ATHNO2HT酮式ATHC烯醇式GCHT酮式212、間接引起置換的誘變劑（DNA復制時摻入）誘變劑均為堿基類似物eg：5－BU（5－溴尿嘧啶），5－AU（5－氨基尿嘧啶），8－NG（8－氮鳥嘌呤）等以5－BU為例：5－BU酮式：與A配對烯醇式：與G配對當微生物培養(yǎng)液中含有5－BU時，細胞內(nèi)有一部分新合成的DNA的T被5－BU取代AT5-BUA5-BU酮式ATG5-BU烯醇式GCA5-BU酮式堿基類似物只對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才有作用，而對靜止細胞、離體DNA沒有作用22（二）嵌合劑和移碼突變移碼突變（frame-shiftmutation）:指誘變劑使DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉錄和翻譯錯誤的一類突變eg：丫啶類染料，包括丫啶橙、核黃素、丫啶黃、

α－氨基丫啶等23（三）輻射誘變

包括UV、X-射線、激光、離子束等1、UV的誘變機制條件：波長254nm，強度15W，距離30cm左右，t不定（10s～2min）機制：形成胸腺嘧啶二聚體（TT）

UV的修復：1）光復活作用：T=TT+T2）SOS修復：應急差錯修復，使突變率增加

可見光光復活酶252、電離輻射的誘變作用X－射線、γ－射線

X－射線作用機制：1）直接作用：DNA雙螺旋氫鍵的斷裂，DNA單鏈的斷裂，DNA雙鏈之間的交聯(lián)等2）間接作用a：使細胞內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫及自由基—誘變劑b：使細胞內(nèi)產(chǎn)生堿基類似物—誘變劑3、激光誘變He-Ne激光26ConjugationTransformationTransduction29一、轉化轉化現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于肺炎球菌中轉化（transformation）:受體細胞直接從周圍環(huán)境中吸收比較大的游離的DNA片段，并整合于受體細胞的基因組中從而使受體細胞獲得供體細胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉染（transfection）:若病毒或噬菌體的DNA轉化感受態(tài)的受體細胞，產(chǎn)生正常的子代病毒或噬菌體的轉化方式。30（一）轉化的前提條件1、感受態(tài)細胞并非所有的細胞都可以吸收DNA，只有在某一條件下培養(yǎng)的部分細胞才有吸收DNA的能力。將有這種能力的細胞稱為感受態(tài)細胞。

感受態(tài)：能接受轉化作用的細胞的生理狀態(tài)感受態(tài)影響因素：菌種、培養(yǎng)時間、菌齡等。2、轉化DNA

dsDNA，分子量106～108道爾頓。31轉化過程32（二）自然轉化的過程與機制以肺炎球菌為例:1、轉化因子（dsDNA）的結合與吸收1）細胞表面的結合dsDNA與受體細胞表面相結合特點：特異性、不可逆性2）轉化因子的吸收降解產(chǎn)生能量協(xié)助把ssDNA推進受體細胞。結合后的dsDNA107Dr片段ssDNA核酸內(nèi)切酶核酸外切酶332、轉化因子的整合

ssDNA以被保護的形式被轉運到受體細胞染色體同源區(qū)段，發(fā)生基因置換式重組。3、轉化子的產(chǎn)生途徑：1）通過錯配修復，將不配對的受體菌堿基切除再經(jīng)修復合成后形成轉化子。若切除的是不配對的供體堿基則不產(chǎn)生轉化子。2）雜合雙鏈分子直接發(fā)生染色體復制，再經(jīng)細胞分裂在部分子代細胞中出現(xiàn)轉化子。34Bacterialconjugation(mating)isaprocessofgenetictransferthatinvolvescell-to-cellcontact.接合（Conjugation）35二、接合（一）接合的概念

接合（conjugation）—在供體菌與受體菌直接接觸時，通過性菌毛的作用，遺傳物質(zhì)從供體菌轉移至受體菌內(nèi)的轉移方式。接合是原核微生物中應用最廣泛的一種遺傳物質(zhì)轉移方式能發(fā)生結合作用的細菌多是G-。接合作用與供體菌中所含的接合因子有關。36以E.coli中F因子的接合作用為例說明：根據(jù)細胞中是否存在有F因子及其存在方式的不同，將E.coli分為四種菌株：

1、F＋菌株細胞內(nèi)有游離的F因子，控制性菌毛的生成及自身的接合轉移。

2、F－菌株細胞內(nèi)無F因子，表面沒有性菌毛。37383、Hfr（高頻重組）菌株

細胞內(nèi)F因子整合到宿主染色體上，隨染色體的復制而復制，但仍有編碼性菌毛及接合轉移的能力。。4、F’菌株—攜帶F’因子的菌株

F’因子－帶有宿主染色體基因的特殊F因子。Hfr菌株中，F(xiàn)因子可以從染色體上切離下來，Hfr菌株變?yōu)镕＋菌株；當不正常切離時，成為F’因子。39

F因子的存在方式及相互關系40

（二）接合的機制1、F＋與F－接合1）胞質(zhì)橋的形成

性菌毛連接細胞后，使細胞緊密接觸，接觸處形成胞質(zhì)橋—F因子的轉移通道2）DNA的轉移

ssDNA進入受體細胞后，兩端相連形成環(huán)狀DNA分子，復制形成dsDNA分子—F因子，最終所以F＋X

F－2F＋。3）分離兩個F＋細胞的分離。41

F+×F－雜交42

2、Hfr與F－的接合過程同F(xiàn)＋與F－的接合遺傳物質(zhì)的轉移順序：

OriT-小段F因子-染色體-大段F因子全部染色體DNA轉入F－菌約需100min，該過程中易受環(huán)境影響而中斷，因此只有一小部分F因子轉移入F－中。3、F’與F－的接合過程同F(xiàn)＋與F－的接合，結果

F’F－2F’。X43Hfr菌株染色體基因轉移4445三、轉導（transduction）轉導：以噬菌體為媒介，將供體菌的遺傳物質(zhì)轉移入受體菌，通過基因重組而使受體菌獲得供體菌的部分遺傳性狀。轉導子（transductant）

通過轉導獲得新的遺傳性狀的受體菌，所用噬菌體均為缺陷型噬菌體（包括溫和、烈性噬菌體）轉導普遍性轉導局限性轉導完全轉導流產(chǎn)轉導46通過完全缺陷的噬菌體將供體菌的任何DNA片段轉移至受體菌的現(xiàn)象分類：1、完全轉導（completetransduction）噬菌體：溫和或烈性噬菌體噬菌體的DNA裝配入衣殼中時，偶爾出現(xiàn)裝配錯誤，裝入與噬菌體DNA大小相似的供體菌DNA片段，形成轉導噬菌體。當供體細胞裂解后，釋放出極少的轉導噬菌體，感染其他受體菌后，通過交換重組，供體菌基因整合入受體菌基因組，形成重組子，即轉導子—遺傳性狀穩(wěn)定，是完全轉導（一）普遍性轉導（generaltransduction）472、流產(chǎn)轉導（abortivetransduction）

經(jīng)轉導獲得供體菌DNA片段的受體菌，若外源DNA在細胞內(nèi)不能整合入受體基因組并復制，也不迅速消失，而僅能表達，該現(xiàn)象稱為流產(chǎn)轉導

在選擇培養(yǎng)基上形成微小菌落48普遍性轉導49（二）局限性轉導（restrictedtransduction）噬菌體：溫和噬菌體

50theDNAoflambdaisinsertedintothehostDNAatthesiteadjacenttothegalactosegenesOninduction,Underrareconditions,thephagegenomeisexcisedincorrectly

AportionofhostDNAisexchangedforphageDNA,calledlambdadgal(dgalmeans"defectivegalactose“)PhagesynthesisiscompletedCelllysesandreleasesdefectivephagecapableoftransducinggalactosegenesSpecializedTransduction(λphage)51普遍性轉導與局限性轉導的區(qū)別區(qū)別要點普遍性轉導局限性轉導基因轉導發(fā)生的時期裂解期溶原期轉導的遺傳物質(zhì)供體菌染色體DNA任何部位或質(zhì)粒噬菌體DNA及供體菌DNA的特定部位轉導的后果完全轉導或流產(chǎn)轉導受體菌獲得供體菌DNA特定部位的遺傳特性轉導頻率受體菌的10-7轉導頻率較普遍轉導增加1000倍(10-4)52（三）溶原性轉換溶原性轉換是當噬菌體感染細菌時，宿主菌染色體中獲得了噬菌體的DNA片段，使其成為溶原狀態(tài)時而致細菌獲得新的性狀。白喉棒狀桿菌與轉導的區(qū)別：噬菌體不攜帶外源基因噬菌體不是缺陷型的不形成轉導子宿主獲得的形狀隨噬菌體的消失而消失53原生質(zhì)體融合（protopastfusion)原生質(zhì)體融合是將兩種不同的菌經(jīng)溶菌酶或青霉素等處理，失去細胞壁成為原生質(zhì)體后進行彼此融合的過程。聚乙二醇可促使二種原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體融合是一種人工基因轉移系統(tǒng)，本質(zhì)上與基因轉移無關或關系很小。54原生質(zhì)體融合（protopastfusion)55第五節(jié)微生物遺傳學的應用一、菌種選育指應用微生物遺傳變異的理論，在微生物群體中選出所需性狀菌種的過程。目的：提高產(chǎn)量、改進菌種質(zhì)量途徑：自然選育、誘變育種、雜交育種56（一）自然選育利用菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程eg：

1、從污染噬菌體的發(fā)酵液中分離抗噬菌體的菌株。

2、酒精工業(yè)中，從產(chǎn)黑色孢子的宇佐美曲霉3758號菌株分離到一株分生孢子為白色的糖化菌種，糖化力增強，培養(yǎng)條件更粗放。自發(fā)突變率低，一般10－9～10－6，正變率更低，所以獲得優(yōu)良菌種的可能性極低誘變育種（突變率提高10～上萬倍）。57正向變異：生產(chǎn)中菌種產(chǎn)量增加的變異負向變異：生產(chǎn)中菌種產(chǎn)量降低的變異（二）誘變育種

利用物理、化學或生物誘變劑，促使微生物發(fā)生突變，再采用一定的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株優(yōu)點：操作簡便，突變率高，周期短缺點：缺少定向性（隨機性大）過程：出發(fā)菌株的制備，誘變處理，篩選目的菌株581、出發(fā)菌株的制備選優(yōu)良的出發(fā)菌株：要求：A、純種，單細胞或單孢子懸液B、對誘變劑敏感：一些菌發(fā)生某一變異后，會提高對其它誘變因素的敏感性C、具有優(yōu)良性狀避免長出不純菌落分散態(tài)的細胞可均勻地接觸誘變劑生長速度快營養(yǎng)要求低產(chǎn)孢子早而多2、誘變處理選擇合適的誘變劑、合適的劑量、合適的中止方法（預實驗）593、篩選突變株

基因突變的類型很多，誘變處理后，會出現(xiàn)各種突變株以營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選為例，說明篩選過程：1）所需培養(yǎng)基A、基本培養(yǎng)基（MM)－僅能滿足某微生物的野生型菌株生長需要的最低組合培養(yǎng)基不同的微生物MM不同，有的極復雜（如乳酸菌的培養(yǎng)基），有的極簡單（如E.coli’sMM）。并非所有的基本培養(yǎng)基都不含有生長因子。60B、完全培養(yǎng)基（CM）－可滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要的培養(yǎng)基。一般是在MM中加入一些富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)（eg：蛋白胨、酵母膏等）配制而成C、補充培養(yǎng)基（SM）－在MM中加入某種微生物的營養(yǎng)缺陷型菌株所不能合成的代謝物所配制的培養(yǎng)基612）與營養(yǎng)缺陷型有關的三類遺傳型個體A：野生型－從自然界中分離得到的發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株B：營養(yǎng)缺陷型－野生型菌株誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變株C:原養(yǎng)型－營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復突變或重組后形成的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同623）篩選過程

誘變劑處理（同一般誘變方法）

淘汰野生型（處理后營養(yǎng)缺陷型的比例一般較低，所以要淘汰野生型）方法：

抗生素法、菌絲過濾法631、抗生素法

a：青霉素法－適用于細菌

原理：青霉素能抑制細菌細胞壁的合成，因此可殺死處于生長繁殖期的細菌，而不能殺死靜止狀態(tài)的細菌。

方法：將誘變后的細菌培養(yǎng)在含青霉素的MM中，殺死大部分生長繁殖活躍的野生型菌株，從而達到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型細胞的目的。b：制霉菌素法－適用于真菌

原理：制霉菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可與真菌細胞膜上的甾醇作用，從而引起細胞膜的損傷。只能殺死生長繁殖著的酵母菌或霉菌，所以可以達到淘汰野生型的目的。642、菌絲過濾法－適用于絲狀真菌或放線菌

原理：MM中野生型的孢子能發(fā)芽長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。

方法：將誘變后的孢子在MM中培養(yǎng)一段時間后，再用擦鏡紙等合適濾紙過濾。重復數(shù)次后，可除去大部分野生型個體，達到“濃縮”的目的。65C：營養(yǎng)缺陷型的檢出多數(shù)營養(yǎng)缺陷型在CM培養(yǎng)基上生長時，菌落形態(tài)和野生型沒有明顯區(qū)別，所以需要檢出。方法：在同一培養(yǎng)皿中檢出：夾層培養(yǎng)法，限量補充培養(yǎng)法在不同培養(yǎng)皿檢出：逐個檢出法，影印接種法66夾層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿中先倒一薄層無菌的MM培養(yǎng)基，冷凝后倒上一層混有經(jīng)誘變處理的菌液的培養(yǎng)基，其上再倒一薄層無菌的MM培養(yǎng)基，成為“三明治”狀。培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落作標記；最后再在皿內(nèi)倒上一薄層第四層培養(yǎng)基－CM，再培養(yǎng)后出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落，多數(shù)是營養(yǎng)缺陷型。限量補充培養(yǎng)法：把誘變處理后的細胞接種在含有微量（0.01%以下）蛋白胨的MM上，野生型生長快，菌落大，而缺陷型菌落小，若想得到某一特定缺陷型菌株，可直接在MM上加入微量的相應物質(zhì)。67逐個檢出法：將誘變后的細胞涂在CM培養(yǎng)基上，長成單菌落后，用接種針或無菌牙簽把單菌落逐個依次點種于MM及CM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，在CM某位置生長而MM相應位置上不生長的是營養(yǎng)缺陷型。影印法：將誘變后的細胞涂布于CM上，培養(yǎng)得到單菌落，用無菌影印裝置把此皿上的菌落轉印到另一MM上，培養(yǎng)后比較兩平板，CM上有而MM上沒有的即為營養(yǎng)缺陷型。68影印培養(yǎng)694）營養(yǎng)缺陷型的鑒定方法：生長譜法（auxanography）步驟：a：菌懸液或單孢子懸液的制備把生長在CM上的營養(yǎng)缺陷型細胞或孢子用無菌水洗下，經(jīng)無菌水洗滌離心（除CM），制備成濃度為107～108個/ml的懸液b：制備混菌平板

取0.1ml與冷卻到50℃左右的MM混合均勻，倒于平皿中70c：分區(qū)加營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基凝固后，在皿背劃分為若干區(qū)域，在正面加微量的氨基酸、維生素、堿基等的粉末或結晶（也可用濾紙片法）d：檢出培養(yǎng)后，某一營養(yǎng)物周圍有微生物的生長圈，說明它是該營養(yǎng)物的營養(yǎng)缺陷型71雜交：細胞水平上的一種基因重組雜交育種：兩個不同基因型的菌株通過一定的方式使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀的菌株育種方法如接合、轉化、轉導（原核生物）；有性、準性生殖（真核生物）；原生質(zhì)體融合等用途：1、改變菌株的遺傳物質(zhì)，獲得雜種菌株2、集中不同菌株的優(yōu)良性狀3、擴大變異范圍，創(chuàng)造新品種（三）雜交育種72二、基因工程（geneengineering）

在誘變育種及分子遺傳學的基礎上，出現(xiàn)的一個人為控制的育種新領域?；蚬こ蹋涸诟鞣N酶的作用下，將目的基因的DNA分子與載體DNA分子相連接，形成重組的DNA分子，以一定的方式導入原無該類分子的宿主細胞，并使宿主生物變?yōu)樽匀唤缭瓉頉]有并能連續(xù)傳代的新生物。工程菌：經(jīng)基因工程改造后的菌株7374（一）基因工程的基本操作1．分離目的基因的DNA片段。2．目的基因與有選擇標記的載體形成重組分子。3．將重組分子導入受體細胞。4．篩選重組轉化子（抗性、酶切、雜交、PCR、測序）。75載體須具備的條件：有自主復制能力較高的復制率最好只有一個限制性核酸內(nèi)切酶切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA