白喉疫苗工藝流程菌種

白喉疫苗工藝流程菌種第1頁/共95頁細(xì)菌性疫苗第2頁/共95頁1.死疫苗2.活疫苗

3.蛋白類疫苗4.多糖類疫苗

5.多糖蛋白結(jié)合疫苗

細(xì)菌性疫苗國藥長春所第3頁/共95頁細(xì)菌性疫苗種類23白喉破傷風(fēng)百日咳疫苗……451霍亂傷寒副傷寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏桿菌傷寒痢疾霍亂疫苗……腦膜炎傷寒vi肺炎流感嗜血桿菌多糖疫苗……AC腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗HIB……腦膜炎傷寒vi流感嗜血桿菌多糖疫苗……國藥長春所第4頁/共95頁百日咳疫苗

傷寒疫苗結(jié)合疫苗

白喉疫苗國藥長春所第5頁/共95頁白喉疫苗一、白喉概述二、病原學(xué)三、白喉桿菌的致病力及毒素產(chǎn)生的遺傳學(xué)四、白喉毒素五、白喉類毒素六、生產(chǎn)工藝七、類毒素的質(zhì)量檢定國藥長春所第6頁/共95頁外毒素對神經(jīng)系統(tǒng)損害細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素對心肌損害外毒素對腎臟損害白喉曾經(jīng)是對兒童威脅非常大的傳染病。它是由白喉棒狀桿菌引起的一種呼吸道傳染病主要臨床表現(xiàn)為上呼吸道發(fā)炎，常常表現(xiàn)在咽部，有時在鼻腔、喉部和氣管，白喉疫苗國藥長春所第7頁/共95頁白喉流行特點(diǎn)1.傳染原：白喉桿菌是嚴(yán)格寄生于人類的細(xì)菌沒有中間宿主，病人及帶菌者是唯一的傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：人對白喉普遍易感，新生兒1歲時白喉易感性達(dá)高峰。國藥長春所第8頁/共95頁二、病原學(xué)1.細(xì)菌形態(tài)

白喉棒狀桿菌菌體一端或兩端膨大呈棒狀，有著色較深的異染顆粒，革蘭氏染色陽性，白喉桿菌無動力，無莢膜，不形成芽孢。國藥長春所第9頁/共95頁白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所第10頁/共95頁國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)第11頁/共95頁2.培養(yǎng)特性白喉桿菌是需氧菌，最適溫度為34～35℃。能分解葡萄糖、麥芽糖和糊精，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉桿菌對抗生素有不同程度敏感，對青霉素和紅霉素極敏感。⑵.對消毒劑抵抗力弱，3％苯酚10min可將該菌殺死⑶.不耐熱，58℃10mi或100℃1min即可被殺死。國藥長春所二、病原學(xué)第12頁/共95頁三、白喉桿菌的致病力及毒素產(chǎn)生遺傳學(xué)1.致病力自然界中動物不感染白喉，只能在敏感動物中造成人工感染。猴、馬、家兔和豚鼠對白喉敏感實(shí)驗室常用的動物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素產(chǎn)生遺傳學(xué)白喉是由白喉桿菌產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素引起的。白喉桿菌的產(chǎn)毒基因是由β嗜菌體攜帶。β嗜菌體感染無毒白喉桿菌后嗜菌體DNA與細(xì)菌DNA整合，形成溶原性白喉桿菌而獲得產(chǎn)毒能力（PW8株目前用于白喉類毒素生產(chǎn))。國藥長春所第13頁/共95頁四、白喉毒素1.白喉外毒素為棒狀桿菌β-噬菌體tox基因表達(dá)產(chǎn)物,可與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合,干擾蛋白質(zhì)的合成，對人和動物都引起致死性毒性，如心臟、腎上腺、肝、腎、胰及神經(jīng)組織等均受到損害。2.白喉毒素是單一多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62kDa,等電點(diǎn)pH4.1，在pH6時加熱55℃很快失活。3.通過物理和化學(xué)方法將其純化。國藥長春所第14頁/共95頁細(xì)菌毒素甲醛類毒素毒素經(jīng)甲醛處理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉類毒素國藥長春所第15頁/共95頁甲醛濃度溫度PH脫毒影響脫毒因素國藥長春所第16頁/共95頁溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果１.溫度越高脫毒越快，超過40℃影響抗原性，一般37～38℃。２.在酸性時脫毒較慢，但游離甲醛含量高，在保存過程中由于甲醛的繼續(xù)作用，可導(dǎo)致脫毒過甚，并影響毒素的穩(wěn)定性；在堿性時脫毒快，但抗原性損失較大，一般采用弱堿性。３.甲醛濃度大則脫毒快，但抗原損失大。國藥長春所第17頁/共95頁溫度升高游離甲醛的濃度低毒素純度高易發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)提高甲醛濃度、脫毒pH、脫毒溫度和延長脫毒時間；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入賴氨酸、精氨酸等）防止或減輕毒性逆轉(zhuǎn)類毒素的毒性逆轉(zhuǎn)國藥長春所第18頁/共95頁六、白喉疫苗工藝流程

菌種（PW8株）

傳代擴(kuò)增3～4代

發(fā)酵罐培養(yǎng)34～35℃培養(yǎng)對數(shù)生長末期收獲，甲苯殺菌。離心去菌體收集清液超濾濃縮

硫酸銨兩段鹽析除鹽除菌氨離子及無菌檢查脫毒甲醛液37℃脫毒試驗（家兔）原液檢定（濃度、純度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品檢定（安全、效價等）國藥長春所第19頁/共95頁七、類毒素的質(zhì)量檢定1絮狀單位（Lf）

是毒素或類毒素與抗毒素的結(jié)合單位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮狀單位標(biāo)準(zhǔn)品來測定類毒素的絮狀單位。

絮狀單位測定

毒素或類毒素與相應(yīng)抗毒素在適當(dāng)?shù)暮?、比例、溫度反?yīng)時間等條件下可在試管中發(fā)生抗原抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的絮狀凝集反應(yīng)，根據(jù)抗毒素絮狀單位標(biāo)準(zhǔn)品可測定類毒素的絮狀單位（Lf）值。2純度：≥1500Lf/mgPN3安全性試驗（豚鼠）國藥長春所第20頁/共95頁七、類毒素的質(zhì)量檢定4效價測定

類毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的免疫應(yīng)答和對相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)。⑴小鼠Vero細(xì)胞法將標(biāo)準(zhǔn)和待檢類毒素2倍稀釋3～5個稀釋度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根據(jù)vero細(xì)胞生長情況，以標(biāo)準(zhǔn)品的效價為標(biāo)準(zhǔn)，用平行線分析法進(jìn)行結(jié)果計算。⑵豚鼠毒素攻擊法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻擊，觀察5天根據(jù)存活率以標(biāo)準(zhǔn)品的效價為標(biāo)準(zhǔn)，用平行線分析法進(jìn)行結(jié)果計算。國藥長春所第21頁/共95頁百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原學(xué)三、百日咳疫苗發(fā)展簡史四、無細(xì)胞百日咳疫苗㈠、生產(chǎn)工藝流程㈡、質(zhì)量檢定㈢、APV的效果㈣、接種不良反應(yīng)國藥長春所第22頁/共95頁急性腦炎、嘔吐、痙攣和昏迷，死亡或腦損傷并發(fā)癥肺炎形成肺氣腫肺不張，甚至死亡。營養(yǎng)缺乏癥百日咳是對兒童威脅非常大的傳染病，它是由百日咳桿菌引起的一種呼吸道傳染病。典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，可持續(xù)數(shù)月。百日咳概述國藥長春所第23頁/共95頁百日咳流行特點(diǎn)1.傳染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：主要傳染對象是6歲以下兒童，1歲以內(nèi)嬰幼兒發(fā)病率50%。國藥長春所第24頁/共95頁二、病原學(xué)㈠細(xì)菌形態(tài)百日咳菌呈革蘭氏染色陰性，短桿狀或橢圓形國藥長春所第25頁/共95頁㈡生長特性1.百日咳菌可分四種相變，Ⅰ相菌毒力最強(qiáng)有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，無免疫原性；ⅡⅢ相菌介于Ⅰ

Ⅳ相之間。2.百日咳菌是需氧菌，最適溫度為35～36℃,最適pH6.8-7.0。3.不發(fā)酵任何糖類、不分解糊精，尿素鹽，不液化明膠不產(chǎn)生吲哚，不利用枸櫞酸鹽。國藥長春所第26頁/共95頁作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--細(xì)胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有兩大類抗原菌體O抗原表面K抗原（莢膜物質(zhì)）2百日咳菌可產(chǎn)生外毒素(PT)內(nèi)毒素其他生物活性物質(zhì)，據(jù)報道有25種之多。㈡、主要抗原和生物學(xué)活性第27頁/共95頁百日咳菌粘附在上呼吸道上皮細(xì)胞纖毛上繁殖↑↓重患

(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮細(xì)胞纖毛上繁殖↓細(xì)菌不進(jìn)入組織和血液循環(huán)

①干擾吞噬細(xì)胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮細(xì)胞功能TCT①產(chǎn)生血細(xì)胞增多③損傷支氣管血管周HLT細(xì)胞代謝發(fā)生變化②組織胺致敏性增強(qiáng)圍組織③分泌胰島素增強(qiáng)和血糖降低.

㈢、致病機(jī)理國藥長春所第28頁/共95頁三、百日咳疫苗發(fā)展簡史㈠粗制百日咳滅活疫苗

第一次世界大戰(zhàn)時期，在對病原菌的生物學(xué)構(gòu)造及其與致病機(jī)理間的關(guān)系缺乏認(rèn)識的前提下，憑經(jīng)驗制造的滅活疫苗，工藝粗造、含量不確定。㈡全菌體百日咳疫苗(WPV)

以標(biāo)準(zhǔn)化方式生產(chǎn)的，制造疫苗的菌株必須含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。經(jīng)過50多年的臨床應(yīng)用證明該疫苗的免疫效果是肯定的，但接種后的不良反應(yīng)問題一直未解決。㈢無細(xì)胞百日咳疫苗(APV)

20世紀(jì)80年代初期，對百日咳菌的成分及其所引起生物學(xué)作用的認(rèn)識，產(chǎn)生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。國藥長春所第29頁/共95頁四、無細(xì)胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在純化出PT和FHA兩種抗原的基礎(chǔ)上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無細(xì)胞百日咳疫苗，并且與白喉和破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制成無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。該疫苗在日本開始正式使用，目前日本已經(jīng)全部取代了菌體百白破疫苗。1992年美國正式批準(zhǔn)使用日本生產(chǎn)的無細(xì)胞百日咳疫苗。美國獲得生產(chǎn)許可證的APV還含有Agg2和PRN。目前WHO已經(jīng)將其作為兒童預(yù)防免疫推薦用疫苗。我國是于80年代中期開始研制無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生產(chǎn)文號。近期的臨床試驗證明含有5種保護(hù)性抗原（PTFHAPRNAgg2

Agg3）的APV效果最佳。國藥長春所第30頁/共95頁

凍干百日咳菌種（Ⅰ相CS菌株）↓接種血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)↓36℃48-72小時培養(yǎng)傳代接種發(fā)酵罐培養(yǎng)（綜合培養(yǎng)基）↓培養(yǎng)≤48小時收集培養(yǎng)物↓第一段硫酸銨鹽析及浸提↓第二段硫酸銨鹽析及浸提↓透析↓密度梯度離心↓戊二醛脫毒↓透析↓超聲↓無細(xì)胞百日咳原液㈠、生產(chǎn)工藝流程國藥長春所第31頁/共95頁檢測項目標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量

——抗原純度測定PT和FHA不低于總蛋白質(zhì)含量的85%熱原測定符合規(guī)定毒性試驗小鼠體重減輕試驗不高于10BWDU/ml小鼠白細(xì)胞增多試驗不高于0.5PLU/ml小鼠組胺致敏試驗不高于0.8HSU/ml毒性逆轉(zhuǎn)試驗不高于0.8HSU/ml效價測定（腦腔保護(hù)力試驗）不低于4.0IU/劑量㈡、質(zhì)量檢定國藥長春所第32頁/共95頁日本和中國的APV和DTPa按以上主要檢定項目進(jìn)行質(zhì)量控制。美國、歐洲一些國家及WHO推薦的毒性和效價測定方法等與之不同。毒性試驗僅要求做HST，效價測定采用ELISA法檢測疫苗注射小鼠后百日咳抗體應(yīng)答水平。用小鼠腦腔保護(hù)力試驗（MPT）評價疫苗效果，WPV的效價明顯高于APV，而且并非所有的APV均可通過MPT試驗。因此還沒有令人滿意的針對APV疫苗的效價試驗方法。免疫原性試驗在衡量制品的一致性方面是有用的，但與臨床保護(hù)之間還缺乏相關(guān)性。國藥長春所效價測定方法探討第33頁/共95頁接種種類免疫人數(shù)病例數(shù)發(fā)病率（%）報道時間WPV56814.31983APV36411.3_584882.8APV30310.01988_423780.0APV2613.81988_271762.9APV6223.21990_373081.0表明APV的保護(hù)效果是肯定的，能夠達(dá)到WPA的保護(hù)水平。㈢、APV的效果國藥長春所第34頁/共95頁疫苗種類發(fā)熱(%)持續(xù)性喊(%)紅暈(%)腫脹(%)疼痛(%)APV0.8-2.84.5-9.01.4-5.51.2-5.51.4-4.8WPV6.620.59.515.420.8表明APV的不良反應(yīng)明顯低于WPV。㈣、接種不良反應(yīng)國藥長春所第35頁/共95頁傷寒疫苗一、概述二、病原學(xué)三、傷寒疫發(fā)展簡史四、傷寒Vi疫苗國藥長春所第36頁/共95頁1.傷寒病是一種急性全身性感染，感染網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)，腸道淋巴組織及膽囊，病原是傷寒沙門氏菌。2.傳播途徑是食入被污染的食物或水源。3.學(xué)齡兒童發(fā)病率最高，兩歲以下兒童和35歲以上成人發(fā)病率低。一、概述國藥長春所第37頁/共95頁1潛伏期為7～21天病期為一個月，恢復(fù)緩慢。3表情遲鈍脈搏相對緩慢，肝脾腫大和白細(xì)胞減少。2長期發(fā)熱、持續(xù)高燒達(dá)10～14天、腹部不適、頭痛等。2長期發(fā)熱、持續(xù)高燒達(dá)10～14天、腹部不適、頭痛等。典型的臨床癥狀國藥長春所第38頁/共95頁二、病原學(xué)1.細(xì)菌形態(tài)傷寒沙門氏菌是革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，能運(yùn)動。國藥長春所第39頁/共95頁傷寒沙門氏菌革蘭染色國藥長春所第40頁/共95頁傷寒沙門氏菌電鏡形態(tài)國藥長春所第41頁/共95頁2.培養(yǎng)特性在肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上以易生長，需氧，適宜溫度35-37℃，適宜的pH為7.0～7.2。發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、蔗糖；氧化酶試驗陰性。第42頁/共95頁1.鞭毛（H）抗原：為蛋白質(zhì)，煮沸破壞，不受（1％）甲醛影響。2.菌體（O）抗原：細(xì)胞壁部份，耐熱，為脂多糖（LPS）－由多糖（重復(fù)寡糖和核心寡糖）和類脂A組成。3.莢膜（Vi）抗原:即莢膜多糖（CPS）,是傷寒桿菌細(xì)胞外壁的一種莢膜抗原,Vi抗原與其致病性有關(guān)

Vi來源于毒力的縮寫?？乖Y(jié)構(gòu)國藥長春所第43頁/共95頁血清學(xué)診斷

1.肥達(dá)氏試驗（widaltest）選擇抗原的方法：⑴.測定O抗體用傷寒0901株（沒有H和Vi抗原）

用加熱殺菌破壞H抗原（不耐熱）

⑵.測定H抗體用傷寒S株（沒有O菌體抗原）

用甲醛處理傷寒沙門氏菌破壞O抗原

2.酶聯(lián)免疫試驗國藥長春所第44頁/共95頁1234全菌體滅活疫苗口服Ty21a減毒活疫苗傷寒Vi多糖疫苗傷寒結(jié)合疫苗二、傷寒疫苗的發(fā)展簡史國藥長春所第45頁/共95頁1甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗2.加熱殺菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮?dú)⒕呙纰?、全菌體滅活疫苗國藥長春所第46頁/共95頁甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗50年代初期學(xué)自前蘇聯(lián)，為傷寒、副傷寒甲乙三聯(lián)疫苗。用１％甲醛殺菌，0.5％石炭酸生理鹽水制成。每毫升含傷寒沙門氏菌體原為1０億-５億；副傷寒甲乙由每毫升各５億-２.5億，細(xì)菌總量原三聯(lián)疫苗為20億-10億。國藥長春所第47頁/共95頁加熱殺菌石碳酸防腐疫苗此法歷史最久，1896年首創(chuàng)的傷寒疫苗即為此法制成，只用56℃水浴30ｍin殺菌加石碳酸防腐制成。美國仍用此法制作標(biāo)準(zhǔn)品。國藥長春所第48頁/共95頁丙酮?dú)⒕呙?921年創(chuàng)制，認(rèn)為對穩(wěn)定Vi抗原有益，系將一份菌液加三份丙酮處理，然后抽氣干燥制成。1943年首次在意大利使用，經(jīng)世界衛(wèi)生組織做現(xiàn)場考核，認(rèn)為效果最好。國藥長春所第49頁/共95頁觀察組觀察人數(shù)中強(qiáng)反應(yīng)百分率(%)第一組1408856.05第二組131315111.50合計27212368.75傷寒、副傷寒甲乙三聯(lián)疫苗接種反應(yīng)

實(shí)踐證明，菌體疫苗預(yù)防傷寒效果肯定的，但接種后的嚴(yán)重反應(yīng)一直困擾著人們。國藥長春所第50頁/共95頁㈡、口服Ty21a疫苗

70年代末期研究成功的口服傷寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21傷寒毒株作為出發(fā)株，用亞硝基胍誘變所得的突變株。國藥長春所第51頁/共95頁口服Ty21a疫苗的特點(diǎn)1.減毒活疫苗此突變株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-異構(gòu)酶半乳糖激酶和半乳糖1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的活性降低約80％。且沒有Vi抗原。所以其毒力減低，但此突變株有完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能誘導(dǎo)較好的免疫保護(hù)性反應(yīng)。2.經(jīng)過多年觀察證明有效，反應(yīng)也較輕。一些國家批準(zhǔn)應(yīng)用。國藥長春所第52頁/共95頁口服Ty21a疫苗的特點(diǎn)3.Ty21a菌株營養(yǎng)要求苛刻，生長緩慢，產(chǎn)量很低，不易批量生產(chǎn)。4.目前無可靠的檢定指標(biāo)。5.基因背景不夠清楚，因為它是用強(qiáng)誘變劑處理而得，作為活疫苗這是它的最大的弱點(diǎn)。國藥長春所第53頁/共95頁地區(qū)疫苗制劑效果效果比較埃及液體＋NaHco3

96%智利腸溶衣膠囊／明膠囊66％ECC、19％明膠ECC＞明膠智利液體／膠囊35%ECC、76%液體液體＞ECC印尼液體／膠囊42%ECC、53%液體液體＞ECC口服Ty21a減毒活疫苗的免疫效果

國藥長春所第54頁/共95頁㈢、傷寒Vi多糖疫苗1.傷寒Vi多糖疫苗的概述2.傷寒Vi多糖疫苗的免疫效果3.傷寒Vi多糖疫苗不良反應(yīng)觀察結(jié)果4.傷寒Vi多糖疫苗的制造工藝5.傷寒Vi多糖疫苗的特點(diǎn)國藥長春所第55頁/共95頁傷寒Vi多糖疫苗概述由于Vi抗原是一種表面抗原，是由C3位乙?；腘-乙酰-D-半乳糖醛酸（1－4）連接的同聚體。在美國NIH的Robbins等重新認(rèn)識傷寒Vi抗原的免疫原性后，并受流腦多糖疫苗的啟發(fā)，用與之類似的方法提取Vi抗原，以不傷害其抗原結(jié)構(gòu)，保持它的免疫原性，制備了傷寒Vi多糖疫苗。國藥長春所第56頁/共95頁傷寒Vi多糖疫苗概述早期提取Vi抗原時為了降低LPS的含量，采取1mol/L乙酸100℃處理24h，使O-乙酰基和N-乙?；撀湓斐蒝i抗原結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致其免疫原性發(fā)生變化。新方法是用十六烷基三甲基溴化銨處理傷寒沙門氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙?；蚇-乙酰基，使其不變性。國藥長春所第57頁/共95頁觀察地區(qū)疫苗人數(shù)觀察時間（月）保護(hù)率（％）尼泊爾傷寒Vi3457（5～44歲）1772南非傷寒Vi5692（5～16歲）2164傷寒Vi多糖疫苗的免疫效果國藥長春所第58頁/共95頁疫苗局部反應(yīng)發(fā)熱率(%)疼痛紅腫硬結(jié)流腦A+C多糖（50μg/人）N=12989（69％）23（18％）21（16％）2（2％）傷寒Vi（25μg/人）N=12778（61％）10（8％）2（2％）1（1％）傷寒Vi（50μg/人）N=12686（68％）9（7％)9（7％）0傷寒Vi多糖疫苗不良反應(yīng)觀察結(jié)果國藥長春所第59頁/共95頁

（Ty2株）

細(xì)菌培養(yǎng)生物反應(yīng)液體培養(yǎng)（8～10h）對數(shù)生長期末收獲,甲醛液滅活離心去菌體，收上清液濃縮多糖上清加10%十六烷基三甲基溴化銨離心收集沉淀，加氯化鈣溶液振蕩解離除去核酸加95%乙醇至25%濃度收集上清上清中加95%乙醇至80%濃度沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白加1：10飽和中性醋酸鈉溶液溶解多糖按1：2加冷酚提取3次，離心收集上清液并透析沉淀多糖透析液加95%乙醇至80%沉淀多糖用無水乙醇和丙酮各洗3次原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀釋分裝成品傷寒Vi莢膜多糖疫苗工藝流程國藥長春所第60頁/共95頁檢定項目檢定指標(biāo)固總測定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜20mg/gO－乙酰基含量≥2mmol/gKd值≤0.25Kd值＜0.25回收率＞50%熱原檢查0.025μg/kg傷寒Vi多糖疫苗檢定項目及檢定指標(biāo)國藥長春所第61頁/共95頁傷寒Vi多糖疫苗的特點(diǎn)安全有效副反應(yīng)較菌體疫苗輕，但卻有其大致相同的免疫效果。穩(wěn)定性好即可以為液體制劑，也可以為凍干制品，耐熱，易于運(yùn)輸與保存。使用方便注射一針，即可以有一定的保護(hù)力，易于用理化方法標(biāo)準(zhǔn)化。同其他多糖疫苗一樣對嬰幼兒免疫效果差。國藥長春所第62頁/共95頁結(jié)合疫苗一、結(jié)合疫苗的特點(diǎn)二、免疫機(jī)理三、用于制備結(jié)合疫苗的多糖抗原四、用于制備結(jié)合疫苗的蛋白載體五、結(jié)合化學(xué)制備結(jié)合疫苗的主要要素六、結(jié)合疫苗應(yīng)具備的兩個共同特征七、結(jié)合疫苗的使用和發(fā)展現(xiàn)狀八、結(jié)合疫苗的研究方向九、存在問題國藥長春所第63頁/共95頁一、結(jié)合疫苗的特點(diǎn)1.抗原物質(zhì)（多糖和蛋白質(zhì)）經(jīng)化學(xué)共價結(jié)合形成了具有一定空間構(gòu)象的結(jié)合物?？乖镔|(zhì)還包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷等小分子物質(zhì)。2.它能使多糖抗原的T細(xì)胞非依賴性轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性,產(chǎn)生具有記憶特征的IgG抗體,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。3.能夠在嬰兒產(chǎn)生免疫應(yīng)答。國藥長春所第64頁/共95頁二、免疫機(jī)理1.胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）2.胸腺依賴性抗原（TD-Ag）國藥長春所第65頁/共95頁胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）細(xì)菌脂多糖、莢膜多糖等。TI-Ag分子結(jié)構(gòu)呈長鏈，O-乙?；?、丙酮?；?、糖苷鍵和磷酸脂鍵等抗原表位重復(fù)排列而成簇，對每種表位來將可視為多價的，能與B細(xì)胞表面受體結(jié)合形成“帽狀現(xiàn)象”。可單獨(dú)觸發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，不需T輔助性細(xì)胞輔助。與TI-Ag發(fā)生應(yīng)答的是B細(xì)胞的抗原識別受體IgM（B細(xì)胞成熟的標(biāo)志），產(chǎn)生的抗體僅為IgM,且抗體效價低、無Ig類型轉(zhuǎn)換。不誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，也不引起免疫記，即使再次采用相同抗原刺激也不能引起初次免疫應(yīng)答，更無抗體親和力成熟過程。國藥長春所第66頁/共95頁TI－AgBIgM無記憶B細(xì)胞（Bm）形成，不產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，因而免疫原性弱。B細(xì)胞對（TI-Ag）應(yīng)答特點(diǎn)國藥長春所第67頁/共95頁胸腺依賴性抗原（TD-Ag）絕大多數(shù)天然抗原（蛋白質(zhì)）都是TD-Ag。TD-Ag分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表位種類多且不均勻(就每種表位而言它是單價的)。此類抗原含有T細(xì)胞和B細(xì)胞決定簇，蛋白質(zhì)通過單價表位的相互作用與B細(xì)胞表面IgM受體結(jié)合，但不誘導(dǎo)“帽狀現(xiàn)象”，不足以激活B細(xì)胞,但被B細(xì)胞胞飲、水解后肽表位與T細(xì)胞受體結(jié)合誘導(dǎo)TH細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。TD-Ag需TH細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子并激活B2細(xì)胞產(chǎn)生抗體,漿細(xì)胞在產(chǎn)生抗體中發(fā)生Ig類型轉(zhuǎn)換，合成IgG和IgM類抗體。形成記憶Bm細(xì)胞，當(dāng)受到相同抗原再次刺激時引起再次應(yīng)答，而且抗體親和力較初次應(yīng)答明顯提高。誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，同時誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。國藥長春所第68頁/共95頁TD-AgIgGIgMTH細(xì)胞細(xì)胞因子B2Bm停止分化記憶B細(xì)胞（Bm）形成，產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，增強(qiáng)免疫原性。B細(xì)胞對（TD-Ag）應(yīng)答特點(diǎn)國藥長春所第69頁/共95頁多糖—蛋白質(zhì)結(jié)合物（TD-Ag）將多糖分子與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，由于蛋白質(zhì)抗原激活TH細(xì)胞，能誘導(dǎo)TH細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子（如r-IFN,IL-2、4、5）并傳遞給B2細(xì)胞，使之參與免疫應(yīng)答。TD-Ag應(yīng)答存在著TH-B2細(xì)胞間的協(xié)作作用國藥長春所第70頁/共95頁多糖—蛋白質(zhì)結(jié)合物（TD-Ag）多糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗免疫優(yōu)勢:1.有TH細(xì)胞參與，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要有IgG和少量IgM，能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和加強(qiáng)免疫應(yīng)答，免疫原性強(qiáng)。2.免疫接種范圍廣，對所有年齡組人群均能提供免疫保護(hù)。國藥長春所第71頁/共95頁抗體生成的輔助細(xì)胞專一地識別載體決定簇

TH細(xì)胞

B2細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的效應(yīng)細(xì)胞專一地識別多糖（半抗原）表面抗原識別受體為IgG和IgM產(chǎn)生IgG和IgM。分化增殖過程中有少量B細(xì)胞停止分化變成記憶Bm細(xì)胞出現(xiàn)加強(qiáng)應(yīng)答免疫原性大大提高細(xì)胞因子TD-AgTD-Ag應(yīng)答存在著TH-B2細(xì)胞間的協(xié)作作用國藥長春所第72頁/共95頁一類是細(xì)菌的莢膜多糖（CPS）A/C群腦膜炎球菌肺炎鏈球菌b型流感嗜血桿菌（Hib）和傷寒桿菌結(jié)合疫苗在動物和人體中均證實(shí)了其安全性和增強(qiáng)的免疫原性。三、用于制備結(jié)合疫苗的多糖抗原國藥長春所第73頁/共95頁另一類為菌體多糖（OPS）脂多糖（LPS）中的O特異性多糖（O-PS）脂寡糖（LOS）中的寡糖（OS）結(jié)合疫苗純化的O-PS和OS沒有免疫原性，與蛋白載體制備結(jié)合疫苗后可獲得免疫原性?？筄-PS的IgG具有型特異性保護(hù)，抗OS抗體具有殺菌活性及免疫保護(hù)作用。三、用于制備結(jié)合疫苗的多糖抗原國藥長春所第74頁/共95頁四、用于制備結(jié)合疫苗的蛋白載體1.細(xì)菌的分泌性毒素（去除毒性）

破傷風(fēng)類毒素（TT）白喉類毒素（DT）及無毒CRM197百日咳毒素（PT）及無毒CRM3201霍亂腸毒素（CT）及其B亞單（CTB）無毒的重組綠膿桿菌外毒素（rEPA）大腸桿菌熱敏感腸毒素（HLT）2.細(xì)菌菌毛

綠膿桿菌菌毛（PAP）淋球菌P-3-2菌毛國藥長春所第75頁/共95頁四、用于制備結(jié)合疫苗的蛋白載體3.細(xì)菌外膜蛋白

B群腦膜炎球菌外膜蛋白（OMP）4.病原蛋白質(zhì)如乙肝表面抗原（HｂsAg）5.B群腦膜炎球菌外膜蛋白（OMP）6.傷寒桿菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLY）也是很有潛力的結(jié)合蛋白。7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸

國藥長春所第76頁/共95頁1.多糖抗原的選擇細(xì)菌的保護(hù)性抗原莢膜多糖（CPS）菌體多糖（OPS）2.多糖分子大小選擇天然多糖經(jīng)降解后的寡多糖。五、結(jié)合化學(xué)制備結(jié)合疫苗的要素國藥長春所第77頁/共95頁3.載體蛋白的選擇破傷風(fēng)類毒素（TT）白喉類毒素（DT）4.多糖和蛋白質(zhì)活性功能基團(tuán)天然的修飾的5.結(jié)合模式五、結(jié)合化學(xué)制備結(jié)合疫苗的要素國藥長春所第78頁/共95頁功能團(tuán)蛋白質(zhì)多糖一類功能團(tuán)（多糖或蛋白質(zhì)原有功能團(tuán)）羧基、氨基、巰基和芳香基羧基、羥基、氨基醛基衍生功能團(tuán)（經(jīng)化學(xué)反應(yīng)可引入功能團(tuán)）氨基、巰基、酰肼馬來亞胺基、鹵代乙基、羧基、氨基、醛基馬來亞胺基、酰肼巰基、鹵代乙?；?.偶聯(lián)反應(yīng)可利用的化學(xué)功能團(tuán)國藥長春所第79頁/共95頁按照結(jié)合方法可分為兩種結(jié)合模式兩種抗原的直接結(jié)合一般限于羧基和具有一級氨基醛基之間的縮合反應(yīng)，其產(chǎn)物需要進(jìn)一步還原才能穩(wěn)定。兩種抗原通過化學(xué)雙功能連接劑的結(jié)合

在多糖和載體蛋白之間使用一個連接物，不但可增加結(jié)合物的收率，而且可大大增強(qiáng)其免疫原性。現(xiàn)有的連接劑按其性質(zhì)可分為兩種。

5.結(jié)合模式國藥長春所第80頁/共95頁

5.結(jié)合模式異種雙功能連接劑：SPDP（Ｎ-琥珀酰胺-3-二硫代呲啶丙酸）同種雙功能連接劑AＤH（已二酰肼）EDAC(碳二亞胺)戊二醛。

不同的連接劑所帶的活性功能團(tuán)不同,因而要求抗原中相應(yīng)不同的活性功能團(tuán)與之反應(yīng)。國藥長春所第81頁/共95頁5.結(jié)合模式按照多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分子構(gòu)象分為兩種連接模式末端連接模式交叉連接模國藥長春所第82頁/共95頁5.結(jié)合模式

末端連接模式

一個載體蛋白上可連接一定數(shù)量的糖鏈，每一條糖鏈上只有一個末端位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，糖鏈與蛋白質(zhì)載體可以直接連接，也可以通過小分子橋連接。

第83頁/共95頁5.結(jié)合模式交叉連接模該模式的每一個載體蛋白或每一個糖鏈上都可以有多個相互連接位點(diǎn)，結(jié)合物形成網(wǎng)狀交連體。隨著糖鏈長度的延長，連接點(diǎn)的增加，交連體的分子質(zhì)量會相應(yīng)增大，其三維空間結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜.國藥長春所第84頁/共95頁方案多糖的活性功能基團(tuán)連接劑選用實(shí)例Ⅰ-CHO–OH直接結(jié)合（氨基還原反應(yīng)）付傷寒甲PS結(jié)合疫苗Ⅱ-COOHADH（酰胺化反應(yīng)）疫疾CSP結(jié)合疫苗Ⅲ苯環(huán)上－OH

-OHCNBr激活A(yù)DH（酰胺化反應(yīng)）Hib結(jié)合疫苗Ⅳ-COOHSPDP（二硫化物交換）傷寒Vi結(jié)合疫苗結(jié)合疫苗制備常用的四種化學(xué)結(jié)合方案國藥長春所第85頁/共95頁

1.氨基還原法（直接