目的基因的克隆與分離鑒定

目的基因的克隆與分離鑒定第1頁/共115頁6目的基因的克隆與分離鑒定目的基因的克隆目的基因的分離鑒定第2頁/共115頁基因克隆與基因分離1、克隆個體水平上的克隆細(xì)胞水平上的克隆分子水平上的克隆第3頁/共115頁2、基因克隆分子水平上的克隆，將某一段DNA或一個基因插入到一個載體分子上，并導(dǎo)入特定的宿主細(xì)胞中，形成寄主/載體單元，稱為一個克隆。3、基因分離從復(fù)雜的基因組中分離出單個具特定功能或特性的基因或DNA片段。該基因的功能或序列并不一定要了解。第4頁/共115頁基因工程或DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因。確定其表達(dá)調(diào)控機制和生物學(xué)功能；建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細(xì)胞）；將目的基因在體外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾；然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。第5頁/共115頁一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；第6頁/共115頁第一節(jié)目的基因的克隆CPCR法BcDNA法A鳥槍法D化學(xué)合成法E基因文庫的構(gòu)建第7頁/共115頁一、鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性第8頁/共115頁(一)鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法（shot-gunapproach)：隨機克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。第9頁/共115頁第10頁/共115頁1.染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端；全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控；

部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。第11頁/共115頁2.與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體；第12頁/共115頁3.轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞；4.篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為的受體細(xì)胞。第13頁/共115頁問題鳥槍法獲得的克隆群體龐大以人的基因組為例，如果載體承受外源DNA片段的能力為1-3kb；那么,人類基因組DNA需被切割成幾十萬個大小不等的片段；每個片段都分別插入到一個載體分子上，這樣就會形成由幾十萬個不同的重組分子組成的克隆群體；要想從如此巨大的克隆群體中篩選帶有目的基因的克隆，顯然是非常費事的。第14頁/共115頁(二)鳥槍法操作的改進如果已知目的基因兩端的酶切位點，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率。

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。第15頁/共115頁例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離；在連接前將DNA片段進行分級分離

2.0kb1.6kb1.8kb用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接。第16頁/共115頁凝膠DNA片段回收技術(shù)

凍融法濾紙法吸附法低融點凝膠法溶解法第17頁/共115頁凝膠DNA片段回收程序

1.切膠回收于離心管中；

2.加入等體積的溶液I；

3.50-60℃水浴加熱約10分鐘至膠融解；

4.加入到DNA純化柱內(nèi)，室溫放置1分鐘；

5.離心1分鐘，倒棄收集管內(nèi)的液體；

6.加入700微升溶液II，室溫放置1分鐘；

7.離心1分鐘，洗去雜質(zhì)；

8.加入500微升溶液II，最高速離心1分鐘；

9.將DNA純化柱置于1.5ml離心管上，加入30ul溶液III至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘；

10.高速離心1分鐘，所得液體即為高純度DNA。第18頁/共115頁(三)鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第19頁/共115頁二、cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法克隆目的基因的局限性第20頁/共115頁(一)cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第21頁/共115頁2.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp

5’第22頁/共115頁DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTT

p5’S15’

AAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’3’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

5’5’AAAAAAAAAAAAAA

3’TTTTTTTTTTTTTT

5’第23頁/共115頁dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs第24頁/共115頁3.雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA與載體的連接：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收第25頁/共115頁(二)cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因第26頁/共115頁三PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。(一)PCR法定向擴增目的基因的基本原理PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。第27頁/共115頁5‘5‘目的基因變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合1235‘第28頁/共115頁

由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆。

(二)PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr第29頁/共115頁四化學(xué)合成法化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略化學(xué)合成的單元操作DNA化學(xué)合成的用途第30頁/共115頁一、化學(xué)合成DNA的發(fā)展二、化學(xué)合成寡核苷酸片段的主要方法磷酸二酯法磷酸三酯法亞磷酸三酯法固相合成法自動化法(ChemicalSynthesisoftheGene)第31頁/共115頁三、化學(xué)合成DNA（寡核苷酸）的應(yīng)用作為合成基因的元件作為測序的引物作為核酸分析雜交的探針用于基因定點誘變研究作為PCR反應(yīng)的引物作為重組DNA連接等的構(gòu)件第32頁/共115頁(一)化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：1.小片段粘接法：

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接連接入合適的載體

第33頁/共115頁2.補釘延長法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第34頁/共115頁3.大片段酶促法：

混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第35頁/共115頁(二)化學(xué)合成的單元操作化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、縮合、氧化、去保護等步驟；從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式；前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的。第36頁/共115頁化學(xué)合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂OHGHHHHOCH2ODMTPOMeOHAHHHHOCH2OO第37頁/共115頁(三)DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設(shè)計新型基因制備探針、引物、接頭如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等。如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等。

第38頁/共115頁全基因合成的問題上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%，則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第39頁/共115頁第一節(jié)目的基因的克隆三、PCR法二、cDNA法一、鳥槍法四、化學(xué)合成法五、基因文庫的構(gòu)建第40頁/共115頁五、基因（組）文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序第41頁/共115頁(一)基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）將特定生物個體的全部DNA片段連接入載體DNA分子上，并導(dǎo)入受體細(xì)菌或細(xì)胞中，經(jīng)擴增產(chǎn)生的包含該生物全部基因組序列的克隆群體。（人工構(gòu)建）基因組文庫（含有全部基因）

cDNA文庫（含有特定時期或組織中蛋白質(zhì)編碼基因）

根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：第42頁/共115頁基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA。用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫。第43頁/共115頁1.重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；2.載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克?。?.克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序；4.克隆片段易于從載體分子上完整卸下；5.重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選；6.具有較高的完備性。基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第44頁/共115頁基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

基因文庫的完備性第45頁/共115頁例如，人的單倍體DNA總長為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb,則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時,基因文庫至少需要180萬個克隆。第46頁/共115頁（二）基因文庫的構(gòu)建程序1.基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂；AAAA制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。第47頁/共115頁2.基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：

第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)

第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭；部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控；連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！第48頁/共115頁3.載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的λ-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動、植物和人類）需使用YAC或BAC載體；由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。第49頁/共115頁λ-DNA上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒15

kb25

kb45

kbBAC300

kbYAC400

kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第50頁/共115頁4.基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：避免外源DNA片段之間的連接?。?！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：

將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端

第51頁/共115頁第二節(jié)基因的分離一、基于基因功能的基因分離技術(shù)二、基于DNA插入作用的基因分離技術(shù)三、基于基因圖譜的基因分離技術(shù)第52頁/共115頁一、基于基因功能的基因分離技術(shù)1、已知目的基因的氨基酸序列2、根據(jù)基因的同源性分離目的基因3、根據(jù)mRNA的特異性分離目的基因第53頁/共115頁1、已知目的基因的氨基酸序列（功能克隆）將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，根據(jù)某些蛋白質(zhì)的氨基酸保守性合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因；將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)抗體探針,從cDNA載體表達(dá)庫中篩選相應(yīng)克隆。根據(jù)某些蛋白質(zhì)的氨基酸保守性設(shè)計特異引物，PCR擴增出目的基因；第54頁/共115頁某段連續(xù)氨基酸序列的簡并探針的序列設(shè)計CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA

C

T

G

G

G

T

TCTGTATGGACGAAATGAA此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計總探針類型：2×2×2×2=16第55頁/共115頁密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆文庫篩選第56頁/共115頁

氨基酸序列

核苷酸序列

PCR特異蛋白質(zhì)

目的基因

抗體

基因文庫篩選評價優(yōu)點

--在單基因性狀的基因分離方面仍為常用策略缺點

--特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難*

--難以分離微量表達(dá)基因

--無法研究無蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因

--難以進行多基因控制性狀的基因分離第57頁/共115頁根據(jù)近緣物種間或進化關(guān)系較近的物種間功能相關(guān)的基因間核苷酸序列的保守性，設(shè)計探針，從基因文庫中篩選并鑒定目的基因。2、根據(jù)基因的同源性分離目的基因文庫篩選法第58頁/共115頁保守序列保守序列5個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的比對結(jié)果第59頁/共115頁A.cDNA的合成cDNA末端快速擴增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)

以mRNA為模板，用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化合成cDNA。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。第60頁/共115頁B.同源片段的克隆簡并引物的設(shè)計利用DNAman、DNAstar等軟件對GENbank中已公布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列進行同源分析，然后，根據(jù)基因的保守區(qū)設(shè)計合成一對簡并引物。簡并引物:是指編碼單個氨基酸的所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少簡并性。第61頁/共115頁Gene1:TTCTATCACGAGTGCTGGPhe–Tyr–His–Glu–Cys–TrpTTTTATCATGAATGTTGGGene2:DegeneratePrimer:5′-TT(T/C)

TAT

CA(T/C)

GA(A/G)

TG(T/C)

TGG-3′氨基酸序列:為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。第62頁/共115頁簡并PCR擴增同源片段瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定；用潔凈的刀片在長紫外燈下切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入1.5ml的微量離心管中；PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，克隆目的片段，并測序鑒定。第63頁/共115頁C.cDNA3'末端序列的克隆3'RACE引物的設(shè)計根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設(shè)計基因特異的巢式引物(nestedPCRprimer)。GSP1和GSP2，巢式PCR擴增cDNA3'末端序列。RNA的提取及cDNA的合成方法同前，但反轉(zhuǎn)錄引物不同(帶有接頭序列)：QT:5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3'可利用此接頭序列設(shè)計兩條接頭引物Q1和Q2。Q1Q2第64頁/共115頁巢式PCR擴增3'-端cDNA以QT引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，分別用基因特異引物GSP1與通用引物Q1進行第一輪PCR；將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，分別用基因特異引物GSP2與通用引物Q2進行第二輪巢式PCR；0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，利用α-互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送測序公司測序。第65頁/共115頁圖ZmABC1-10

基因全長cDNA克隆第66頁/共115頁D.cDNA5'末端序列的克隆5'RACE引物的設(shè)計根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設(shè)計基因特異的巢式引物（nestedPCRprimer）。GSP1和GSP2，巢式PCR擴增cDNA5'末端序列。第67頁/共115頁1）TaKaRa公司RACE原理添加接頭序列②以RNaseH分解掉cDNA-RNA雜交體中RNA；①利用一5’端磷酸化的特異性引物對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄形成5’端磷酸化的cDNA第一鏈；③在T4RNA連接酶的作用下將單鏈cDNA環(huán)化或首尾相連；④用兩對基因特異性引物：A1、S1及A2、S2分別進行二次PCR擴增得到所需目的片段第68頁/共115頁2）

Clontech公司的SMART5'

-RACE的原理①以O(shè)ligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA；②利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的3′末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭；第69頁/共115頁③然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（UniversalPrimer）作為上游引物，用一個基因特異引物（GeneSpecificPrimer，GSP）作為下游引物，PCR擴增目的基因5′末端的cDNA片段第70頁/共115頁3）Invitrogen的GeneRACER5'-RACE的原理5’mRNACAP3’PolyAtailFull-lengthmRNAm7G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/TruncatedmRNAP/Non-mRNA第71頁/共115頁CIPm7G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA①去磷酸化反應(yīng):利用堿性磷酸酶(如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，水解掉RNA5'末端的磷酸。但CIP不能破壞mRNA5'末端的帽子結(jié)構(gòu)；第72頁/共115頁②去帽反應(yīng)：利用煙草焦磷酸酶TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）消化掉mRNA5'末端的帽子結(jié)構(gòu)；m7G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/TAP第73頁/共115頁③接頭連接：將經(jīng)去磷酸化和去帽處理的RNA轉(zhuǎn)入另一PCR管中，加入RNA接頭片段，在RNALigase作用下，將RNAOligo接頭連接于去帽的mRNA5'末端；AAAAAAAAAAAARNALigaseRNAOligoAAAAAAAAAAAAP/第74頁/共115頁④反轉(zhuǎn)錄：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;RTAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAARNAOligo第75頁/共115頁TTTTTTTTTTTTT⑤

巢式PCR：利用接頭的通用引物UP（UniversalPrimer）和基因特異引物，巢式PCR獲得基因5’片段。UPGSP5'cDNA第76頁/共115頁⑥

巢式PCR擴增全長cDNA：根據(jù)已獲得目的基因的3‘序列和5’序列，設(shè)計基因特異的巢式引物5‘GSP和3’GSP，巢式PCR擴增cDNA全長序列。TTTTTTTTTTTTT5'GSP3'GSPPCR第77頁/共115頁差別雜交Differentialhybridization扣除雜交Substractivehybridization抑制性消減雜交Suppressionsubstractivehybrid差別顯示Differentialdisplay基因芯片技術(shù)Genechips3、根據(jù)mRNA的特異性分離目的基因第78頁/共115頁差別雜交(Differentialhybridization)又叫差別篩選(Differentialscreening)，適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA之cDNA克隆。差別雜交的技術(shù)基礎(chǔ)十分簡單，它不需要任何有關(guān)目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要擁有兩種不同的細(xì)胞群體。3.1差別雜交第79頁/共115頁1）差別雜交的操作程序mRMAmRMAcDNA探針cDNA探針cDNAcDNA文庫表達(dá)目的基因mRNA的細(xì)胞不表達(dá)目的基因mRNA的細(xì)胞原初平板影印影印第80頁/共115頁2）差別雜交的局限性差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐度的mRNA而言，這個缺點就顯得更為突出。差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此成本較高、工作量較大。由于兩套平行轉(zhuǎn)移的濾膜之間，DNA的保有量往往會有差別，導(dǎo)致雜交信號的強度不一致，從而降低了此法的可重復(fù)性。第81頁/共115頁不表達(dá)目的基因的總mRNA表達(dá)目的基因的總mRNAcDNA雜交DNA-RNA雜交分子游離的單鏈mRNA分子3.2扣除(消減)雜交(Subtractivehybridization)第82頁/共115頁差異分離程序

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因

例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是：分離克隆這些新基因，進而研究其生物學(xué)功能。第83頁/共115頁多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因cDNA克隆第84頁/共115頁3.3抑制性消減雜交(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟融為一體的技術(shù)；抑制性PCR是利用鏈內(nèi)復(fù)性優(yōu)先于鏈間復(fù)性的原理，是非目標(biāo)序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在復(fù)性時產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)或“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”而無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目標(biāo)序列的擴增。第85頁/共115頁(Inexcess)第86頁/共115頁第87頁/共115頁第88頁/共115頁總mRNA（B）總mRNA（A）cDNAcDNA電泳，顯影比較差異條帶RT-PCR（加入已標(biāo)記的dCTP)3.4差別顯示(Differentialdisplay)第89頁/共115頁第90頁/共115頁基因芯片(genechip)基因芯片又稱為DNA微陣列(DNAmicroarray)，它是指通過微電子技術(shù)和微加工技術(shù)將大量特定序列的探針有序地固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進行雜交，通過雜交信號的強弱檢測靶分子的一種檢測工具。基因芯片技術(shù)上的特點是具有高度可行性、多樣性、微型化和自動化四大特點。第91頁/共115頁激光共聚焦熒光掃描顯微鏡檢測雜交信號

第92頁/共115頁二、基于DNA插入作用的基因分離技術(shù)1、原理：由于插入的DNA序列相當(dāng)于人為地給目的基因加上一個序列標(biāo)簽，因此用此DNA插入突變分離基因的技術(shù)又稱為DNA標(biāo)簽法(DNAtagging).當(dāng)一段特定的DNA序列插入到基因組中某一個基因的內(nèi)部或其鄰近位點時，便會誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導(dǎo)致表型變化，形成突變體。如果此段DNA插入序列是已知的，則可作為DNA雜交的分子探針，從突變體基因組DNA文庫中篩選到突變基因。再以突變基因為探針，從其原始個體的基因組DNA文庫中篩選目的基因。第93頁/共115頁利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用使被插入的目的基因突變失去活性，而轉(zhuǎn)座子的刪除作用又可使目的基因復(fù)活。2、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（Transposontagging)第94頁/共115頁第95頁/共115頁根癌農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)可轉(zhuǎn)移入特定的宿主細(xì)胞中，并整合到基因組DNA上，從而可作為特定的標(biāo)簽序列。3、T-DNA標(biāo)簽法（T-DNAtagging)第96頁/共115頁第97頁/共115頁三、基于基因圖譜的基因分離技術(shù)圖位克隆(map-basedcloning)又稱定位克隆(positionalCloning)，1986年首先由劍橋大學(xué)的AlanCoulson提出。用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。第98頁/共115頁1、原理：在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行逼近目的基因或通過染色體登陸的方法最終找到包含該目的基因的克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終確定目的基因的堿基序列。第99頁/共115頁構(gòu)建遺傳分離群體：F2、BC、DH、RIL找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體的特定位置；構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(BAC或YAC庫)；以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫；用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群；通過染色體步行、登陸獲得含有目標(biāo)基因的大片段克?。煌ㄟ^亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??；通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列。2、圖位克隆基本程序第100頁/共115頁高密度的分子標(biāo)記圖譜3、要求：與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記高質(zhì)量的基因組DNA文庫連鎖分析需要依賴特定的序列作為連鎖標(biāo)記，即標(biāo)記序列與待研基因之間存在連鎖關(guān)系，而滿足與待研基因相連鎖的標(biāo)記實在太少，所以連鎖分析對克隆大多數(shù)基因存在著一定的困難。第101頁/共115頁RFLP的出現(xiàn)使多態(tài)性基因標(biāo)記存在于整個基因組內(nèi)，解決了連鎖分析中難以克服的困難。

1980年Wyman等科學(xué)家首次建立了限制酶切片段長度多態(tài)性RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)，使對任何一種表型相關(guān)的基因的定位成為可能。第102頁/共115頁其它常用是分子標(biāo)記

隨機擴增多態(tài)性DNA(RandomAmplified

PloymorphicDNA,RAPD)由Williams等于1990年創(chuàng)立。此技術(shù)建立于PCR基礎(chǔ)之上，使用一系列具有10個左右堿基的隨機引物，對基因組的DNA進行PCR擴增，以檢測其多態(tài)性；由于整個基因組中存在眾多反向重復(fù)序列，因此，單一引物可與反向重復(fù)序列結(jié)合，使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴增其多態(tài)性；引物結(jié)合位點DNA序列的改變，以及兩擴增點之間