RNA干擾技術基本原理與應用2

RNA干擾技術基本原理與應用演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期一優(yōu)選RNA干擾技術基本原理與應用ppt現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期一什么是RNA干擾

RNA干擾(RNA

interference，RNAi),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導入到細胞內(nèi)，使目的基因的不表達或表達水平下降.2001、2002年連續(xù)被Science評為年度十大成就!現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期一目前應用的基因干擾技術DNA水平的基因干擾技術基因敲除技術寡核苷酸與雙鏈DNA雜交采用多胺等小分子識別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期一目前應用的基因干擾技術mRNA水平的基因干擾技術用反義RNA技術阻遏翻譯過程,破壞內(nèi)源性mRNA設計寡核苷酸來破壞與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì),使mRNA不穩(wěn)定雙鏈RNA干擾技術（RNAi）現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1984年,Jonathan研究小鼠L細胞時發(fā)現(xiàn)反義mRNA會干擾同源基因的表達，機制不清1990年Jorgensen等矮牽牛顏色加深實驗

“共抑制(co-suppresion)”現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1995年SuGuo和KenEmphues

反義RNA阻斷秀麗小桿線蟲par-1基因的表達實驗首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象1998年AndrewFire和CraigMello

發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑制基因的表達

Nature1998；391:806-11

正式提出RNA干擾的概念現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1999年Tuschl等報道在哺乳動物中也存在RNAi2001

年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分解dsRNA為siRNAs(short/smallinterferingRNA)的DICER酶現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程2002

年Novina等

用RNAi技術實現(xiàn)了對HIV-1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技術實現(xiàn)了對人細胞基因的抑制

Science2004(August27)；305：1289-1292現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的主要特點和優(yōu)勢誘導轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默具有高度的特異性抑制基因表達的效率非常高可在不同細胞之間傳遞甚至傳到子代中去

“基因沉默系統(tǒng)化”現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

共同點特異性靶向性現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

不同點獨特的雙鏈結(jié)構(gòu)需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等協(xié)同因子siRNA本身無催化活性在細胞內(nèi)可能具有相對的穩(wěn)定性具有一定的可遺傳性現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的主要過程啟動階段

dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNA

長度：21-25nt

結(jié)構(gòu)：3ˊ端懸垂兩個未配對的堿基UU現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期一細胞中內(nèi)源性dsRNA的形成基因組中DNA反向重復序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA病毒RNA復制中間體以單鏈RNA為模板由細胞或病毒的RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期一Dicer酶RNAaseIII超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點對單鏈RNA沒有活性對200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA廣泛存在現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期一RdRp（RNAdependentRNApolymerase）使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA參與細胞內(nèi)dsRNA和siRNA的擴增siRNA與靶mRNA的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi的主要過程效應階段RNA誘導沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成

siRNA、核酸內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶RISC的激活：ATP依賴的解雙鏈過程在siRNA反義鏈的指導下，RISC特異性切割、降解靶mRNA，導致基因表達失活現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi技術的實驗方法siRNA的設計原則序列大小19-21nt，最好以A或G開始從mRNA的AUG開始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點不要針對5‘和3’端非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)

現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi技術的實驗方法siRNA的設計原則設計2~4個序列,BLAST比對基因序列以確保序列設計的特異性優(yōu)先選擇GC含量30-50%的序列設計適當?shù)年幮詫φ招蛄鞋F(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期一陰性對照序列的設計特異性siRNA中的堿基進行隨機排列，且行BLAST基因比對

AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG

ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特異性siRNA引入1~2個錯配堿基

AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期一目標序列篩選的相關網(wǎng)站/Stu/shilin/rnai.html/sirna.pl/rnai/http://RNAiD/rnaidesigner/:9331/RNAi/html/rnai.html

現(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期一查找已經(jīng)證實的siRNA的網(wǎng)站/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA的制備方法體外制備方法化學合成siRNA體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA利用Dicer或RNaseⅢ消化長的dsRNA成siRNA現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期一化學合成法制備siRNA優(yōu)點：

純度高合成量不受限能被標記缺點：價格昂貴、合成周期長用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期一體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA優(yōu)點：簡單成本低速度快毒性小穩(wěn)定性好

缺點：反應規(guī)模和量始終有一定的限制用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種

siRNAs

現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期一消化法（“siRNAs雞尾酒”）優(yōu)點：無需檢測或篩選多個siRNA序列

產(chǎn)生多種siRNAs混合體，保證有效的目的基因沉默缺點：有可能引發(fā)非特異的基因沉默

用途：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型

現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA的制備方法細胞內(nèi)制備方法依賴表達質(zhì)粒或病毒載體在細胞內(nèi)獲取siRNA通過PCR介導的siRNA表達試劑盒獲取siRNA現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA載體依賴RNA聚合酶III啟動子(polIII)

，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達。

人源U6啟動子鼠源的U6啟動子人H1啟動子polIII可在細胞中表達許多的小分子RNA，通過添加一串（3~6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中

現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期一表達載體法制備siRNA優(yōu)點：可以進行較長期研究。載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因達數(shù)星期或更久缺點：需要進行克隆，周期長質(zhì)粒載體表達效率較低用途：唯一可以用于長期基因沉寂研究的方法現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期一基于PCR的siRNA表達框架(SECs)組成：RNApolIII啟動子發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNARNApolIII終止位點制備：PCR，無需克隆和測序現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期一用SECs制備siRNA優(yōu)點：可直接由PCR得到，方法簡便，時間短在PCR片段兩端添加酶切位點，篩選出最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達載體可以用來篩選特定研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配

現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期一用表達框架制備siRNA缺點：PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想

用途：篩選siRNA序列在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動子

現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期一shRNA(shorthairpinRNA)文庫

Nature2004；428：427-431(25March)

針對：9,610humangenes5,563mousegenes

構(gòu)建成：28,000個shRNA表達盒(cassettes)商品化試劑盒：ExpressionArrest?(美國冷泉港實驗室OpenBiosystems公司)

網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆，無需再耗時耗力進行siRNA的設計、合成和驗證過程現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期一CAM:氯霉素抗性基因hr：同源重組位點Barcode：每個shRNA獨特的識別序列MSCV：病毒載體骨架PKG-Puro：哺乳動物細胞中載體穩(wěn)定性的選擇Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號序列現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNAshRNA使用代價高相對較低持久性最多2周可選擇獲得穩(wěn)定整合的細胞宿主類型細胞系原代細胞，胚胎干細胞、細胞系設計復雜的設計方法完成獲取需要合成完成應用瞬時轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、病毒侵染檢測方法Western雜交、表型分析RT-PCR、芯片檢測Western雜交、表型分析、RT-PCR、芯片檢測研究領域細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)&體內(nèi)研究現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期一現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期一siRNA轉(zhuǎn)染細胞.磷酸鈣共沉淀電穿孔法DEAE-葡聚糖和polybrene機械法：顯微注射和基因槍陽離子脂質(zhì)體試劑現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期一提高轉(zhuǎn)染效率的方法純化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染較低傳代數(shù)的細胞合適的轉(zhuǎn)染試劑合適的陽性對照熒光標記的siRNA現(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期一RNAi技術的應用基因組功能研究的新方法研究信號傳導通路的新途徑開展基因治療的新策略（抗病毒、抗腫瘤等）篩選藥物靶點的新工具現(xiàn)在是48頁\一共有