細胞實驗二細胞損傷與保護

細胞實驗二細胞損傷與保護第1頁/共28頁細胞實驗（二）

細胞損傷與保護2設(shè)3組不同的細胞組正常、損傷、損傷恢復(fù)用不同的實驗方法檢測、驗證實驗結(jié)果

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實驗內(nèi)容細胞電子顯微鏡檢測細胞活率測定亞細胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定第3頁/共28頁實驗設(shè)計1.（電鏡）每班傳細胞入含小蓋片培養(yǎng)瓶6瓶（2組）

2瓶正常、4瓶損傷、第二天2瓶損傷后恢復(fù)2.（活率）每組傳細胞入96孔培養(yǎng)板9孔

3孔正常、6孔損傷、第二天3孔損傷后恢復(fù)3.（分離）每班傳代細胞8瓶

4瓶細胞1傳2至25ml培養(yǎng)瓶成8瓶細胞第4頁/共28頁細胞電子顯微鏡檢測細胞電鏡標(biāo)本制備第5頁/共28頁原理

光學(xué)顯微鏡無法看清小于0.2um的細微結(jié)構(gòu)，我們把這些細微結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。要看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。第6頁/共28頁

電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)，從原理上來說是相似的，但也有不同之處。第7頁/共28頁首先不同的是用電子束（電子流）代替照明光源。其次，電鏡使用的是電子透鏡，而不是光學(xué)透鏡，電子透鏡不是肉眼可見的物質(zhì)透鏡，它是由磁或電所形成的磁場或電場的局部空間來起到透鏡的作用。第三個區(qū)別是成像原理不同。其成像是由于標(biāo)本中不同結(jié)構(gòu)中原子與電子發(fā)生碰撞后，造成電子散射角度不同，使熒光屏上的電子強度也相應(yīng)不同。第8頁/共28頁電鏡制樣技術(shù)

由于電子束的穿透能力有限，為了獲得較高分辨率，需要使用超薄切片機制成厚度一般僅為40～50nm的超薄切片。這就需要樣品有一定的剛性和韌性，為此，樣品需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋的過程會破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此超薄切片樣品制備的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。第9頁/共28頁

超薄切片的制備1、固定：戊二醛和（OsO4）等，鋨酸后固定。2、包埋：環(huán)氧樹脂和丙烯酸樹脂等。3、切片：玻璃刀用超薄切片機切片，厚度40～50nm，切片收集在銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)上，在電鏡下觀察。4、染色：常用的染色液是醋酸雙氧鈾（易染核酸）和鉛鹽（易染蛋白質(zhì)）。第10頁/共28頁結(jié)果在電子顯微鏡下觀察比對正常、損傷及損傷后恢復(fù)標(biāo)本照相分析總結(jié)第11頁/共28頁要求送標(biāo)本照片結(jié)果分析第12頁/共28頁細胞活率測定MTT比色法第13頁/共28頁原理四甲基偶氮唑鹽(噻唑藍MTT)是一種能接受Ｈ原子的染料?？赏高^細胞膜進入細胞內(nèi)?；罴毎€立體中琥珀酸脫氫酶，能使外源性淡黃色的(MTT)還原成難溶于水的結(jié)晶，并沉淀在細胞中。其形成量與活性呈正相關(guān)。該結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀，在波長492nm測定其光吸收值?？砷g接反映活細胞的數(shù)量變化。第14頁/共28頁器材與試劑器材：培養(yǎng)細胞(96孔細胞培養(yǎng)板)酶標(biāo)儀、移液搶、搶頭等試劑：5mg/mlMTT溶液二甲亞砜（DMSO）溶液

DMEM培養(yǎng)液（高糖、無糖）第15頁/共28頁

實驗步驟1、接種1.5×104/ml細胞于96孔板：每組9孔2、每孔加200ul培養(yǎng)液：3孔正常（高糖）、

3孔損傷（無糖）、3孔損傷恢復(fù)（無糖有糖），37oC、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)；3、測定前2h，每孔吸棄原培養(yǎng)液，加高糖培養(yǎng)液180ul、再加MTT溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)；4、到2h測定時，每孔吸棄培養(yǎng)液，加DMSO

溶液150ul，振蕩5分鐘；5、酶標(biāo)儀492nm波長處比色。5h第16頁/共28頁結(jié)果記錄酶標(biāo)儀上光吸收值分析每組細胞生長情況第17頁/共28頁注意事項每孔的細胞密度不能超出1x105/ml

，避免影響實驗的區(qū)分度；高濃度血清會導(dǎo)致實驗本底增高，比色前盡量使血清濃度不超過10%。第18頁/共28頁亞細胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定細胞核的提取第19頁/共28頁原理

細胞內(nèi)各種細胞器質(zhì)量不同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同。根據(jù)這一原理，常用差速離心法、密度梯度離心法來分離各種細胞器。分離的各種細胞器可以用組化等方法加以鑒定。第20頁/共28頁本實驗利用此原理僅對細胞核進行分離、鑒定，其上清液可作進一步分離。第21頁/共28頁器材與試劑細胞株CHL離心機、天平、離心管、顯微鏡、染色缸、滴管等消化液、0.075MKCl、0.25%蔗糖溶液、甲醇固定液、Giemsa染液第22頁/共28頁

操作

收集細胞（消化法）——

離心(1000/min×5’)——沉淀加0.075MKCl4ml，沖打，靜置20min——離心(1500/min×10’)——

取沉淀加蔗糖溶液4ml，打勻——離心（2500/min×10’）

——取沉淀加少量固定液涂片——酒精燈烤干——甲醇固定5’——Giemsa染色5’——自來水沖洗——吸水紙吸干玻片（反面）——顯微鏡10倍或40倍下觀察（鑒定）第23頁/共28頁結(jié)果細胞核染成深蘭色第24頁/共28頁注意事項注意正確使用離心機（平衡、對稱）正確使用顯微鏡染液臨用前稀釋（PBS：Gimsa原液9：1）ba