檢驗科微生物室專家講座

臨床微生物質(zhì)量控制檢驗科微生物室專家講座第1頁內(nèi)容二、臨床微生物質(zhì)量控制三、試驗前質(zhì)量控制四、試驗中質(zhì)量控制五、試驗后質(zhì)量控制六、工作中常見問題和處理方法七、目標(biāo)一、臨床微生物試驗室主要性檢驗科微生物室專家講座第2頁一、臨床微生物試驗室主要性人類面臨著微生物挑戰(zhàn)，要打贏這場戰(zhàn)爭不但需要有經(jīng)驗醫(yī)生，還需要一支優(yōu)異臨床微生物檢驗隊伍。與過去10年或20年相比，臨床微生物試驗室規(guī)模和發(fā)展速度已經(jīng)發(fā)生了巨大改變。當(dāng)前，我們離CLSI(臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會)標(biāo)準(zhǔn)化文件要求還相差很遠(yuǎn)，我們應(yīng)進(jìn)行規(guī)范操作，才可能應(yīng)對微生物向人類挑戰(zhàn)，才能適應(yīng)臨床需要。臨床微生物檢驗，在感染性疾病及相關(guān)病患診療治療預(yù)防及研究工作中起著越來越主要作用，為了保障檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性，日常工作中要注意開展質(zhì)量控制。檢驗科微生物室專家講座第3頁臨床微生物檢驗?zāi)繕?biāo)和意義提供感染性疾病診療病原學(xué)依據(jù)為醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)為感染性疾病治療提供用藥依據(jù)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測需要為合理使用抗菌藥品提供依據(jù)為生物安全、醫(yī)院感染管理和監(jiān)控預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)檢驗科微生物室專家講座第4頁為了確保檢驗結(jié)果準(zhǔn)確無誤，應(yīng)對室間質(zhì)評和室內(nèi)質(zhì)控實施全方面質(zhì)量管理。臨床微生物檢驗是對人體各種物質(zhì)進(jìn)行微生物學(xué)檢驗，整個檢驗過程包含病人樣品采集、運輸、處理，樣品中致病微生物分離、培養(yǎng)、判定，藥品敏感試驗，出具檢驗匯報。其質(zhì)量控制步驟多、包括知識面廣、復(fù)雜性高、需要超強責(zé)任心。二、臨床微生物質(zhì)量控制檢驗科微生物室專家講座第5頁臨床微生物檢驗質(zhì)量控制相關(guān)概念為了確保質(zhì)量控制，首先應(yīng)了解以下相關(guān)概念：細(xì)菌檢驗質(zhì)量：結(jié)果真實顯示標(biāo)本中存在病原菌及其生化特征和抗藥性細(xì)菌檢驗質(zhì)量控制：制訂細(xì)菌檢驗質(zhì)量水平，并采取監(jiān)測伎倆，這一過程稱為細(xì)菌檢驗質(zhì)量控制。質(zhì)量確保：為到達(dá)應(yīng)有質(zhì)量水平而采取辦法。質(zhì)量評價：用一個客觀公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)來評定一個試驗室或試驗室中某項試驗是否到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)過程。檢驗科微生物室專家講座第6頁室間質(zhì)量控制：是各地試驗室之間進(jìn)行質(zhì)量控制一個方式，也是上一級試驗室對各試驗室進(jìn)行質(zhì)量管理伎倆。參加由省臨床檢驗中心或衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織室間質(zhì)控，會遇見一些平時罕見或未見過菌株，經(jīng)過質(zhì)控檢驗對它們生長條件、菌落形態(tài)、染色、鏡下形態(tài)等有了較深感性認(rèn)識。日后工作中倘若再遇見這些菌將不再見漏檢。檢驗科微生物室專家講座第7頁室內(nèi)質(zhì)量控制：做好室內(nèi)質(zhì)控直接關(guān)系到日常檢驗工作質(zhì)量。室內(nèi)質(zhì)控主要包含幾個方面：試驗室前質(zhì)量控制、標(biāo)本接種前質(zhì)量控制、培養(yǎng)基質(zhì)量控制、試劑質(zhì)量控制、慣用儀器質(zhì)量控制、藥敏試驗質(zhì)量控制、及發(fā)匯報前質(zhì)量控制。檢驗科微生物室專家講座第8頁分析后質(zhì)量控制范圍分析前分析中質(zhì)量保持連續(xù)改進(jìn)檢驗科微生物室專家講座第9頁

臨床微生物質(zhì)量控制依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，美國臨床試驗標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）定時頒布最新質(zhì)量控制和評議方案。檢驗方法學(xué)、操作手冊應(yīng)不停更新，開展循診醫(yī)學(xué)，不停淘汰無價值試驗，增加新有臨床價值試驗。檢驗科微生物室專家講座第10頁微生物試驗室程序臨床微生物制度生物安全防護(hù)制度三級匯報制度：①涂片；②初步藥敏和確切涂片；③正式判定和藥敏傳染病原匯報制度菌毒株保留制度廢棄物處理制度質(zhì)量控制制度制訂程序性文件（可參考ISO15189認(rèn)可準(zhǔn)則中應(yīng)用說明要求）SOP操作手冊儀器性能驗證等檢驗科微生物室專家講座第11頁為了確保質(zhì)量控制，我們需注意：標(biāo)本質(zhì)量（數(shù)量、體積、可接收合格標(biāo)本、運輸方式等）試驗方法有效性（依據(jù)臨床癥狀、診療和其它臨床資料，采取適當(dāng)檢測方法）試驗操作方法和步驟、試劑、培養(yǎng)基、儀器、環(huán)境、人員等。有臨床意義結(jié)果匯報（匯報及時、準(zhǔn)確、完整）檢驗科微生物室專家講座第12頁臨床微生物試驗室基本裝備孵育箱、CO2培養(yǎng)箱、高壓滅菌器生物安全柜試劑、染液、質(zhì)控菌株、培養(yǎng)基冰箱、酒精燈、接種環(huán)、游標(biāo)卡尺、溫度計等光學(xué)顯微鏡檢驗科微生物室專家講座第13頁室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控內(nèi)容包含對各種試驗條件及試驗過程進(jìn)行監(jiān)督監(jiān)督對象有儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、判定系統(tǒng)等操作全過程室間質(zhì)評檢驗科微生物室專家講座第14頁臨床微生物室需建立室內(nèi)質(zhì)控

11234常規(guī)試驗室內(nèi)質(zhì)控培養(yǎng)基質(zhì)控藥敏試驗質(zhì)控自動化設(shè)備質(zhì)控：判定和藥敏、血培養(yǎng)系統(tǒng)檢驗科微生物室專家講座第15頁ATCC：美國經(jīng)典菌株保留中心-主要起源NCTC：英國國家經(jīng)典菌株保留中試驗中用標(biāo)準(zhǔn)方法判定，判定值>95％經(jīng)典菌株，并經(jīng)屢次傳代，特征衡定菌株質(zhì)控菌株

參考菌株臨床分離菌檢驗科微生物室專家講座第16頁質(zhì)控必備菌株細(xì)菌名稱菌號用途金黃色葡萄球菌ATCC25923紙片擴(kuò)散質(zhì)控金黃色葡萄球菌ATCC29213MIC測定質(zhì)控大腸桿菌ATCC25922紙片和MIC綠膿假單胞菌ATCC27853紙片和MIC糞腸球菌ATCC29212胸腺嘧啶含量測定淋病奈瑟菌ATCC49226淋球菌藥敏流感嗜血桿菌ATCC49247嗜血桿菌藥敏肺炎克雷伯菌ATCC700603ESBL陽性菌檢驗科微生物室專家講座第17頁低溫速凍苛養(yǎng)細(xì)菌冷凍干燥長久保留菌株參考菌株保留方法高層瓊脂非苛養(yǎng)菌瓊脂斜面現(xiàn)用菌株參考菌株保留方法檢驗科微生物室專家講座第18頁室間質(zhì)評—樣本檢測操作程序1.測試環(huán)境、儀器、試劑要求室溫：20～25℃濕度：<80%試劑：所用試劑或試條均為儀器配套產(chǎn)品質(zhì)控品：為儀器配套產(chǎn)品，并在使用效期內(nèi)，同時無變質(zhì)或污染。儀器：儀器必須有質(zhì)量控制確保。2.質(zhì)評樣品準(zhǔn)備按測定日期從冰箱中取出參評物，放置至室溫(約30min)。依據(jù)標(biāo)本種類，質(zhì)控菌株進(jìn)行培養(yǎng)分離判定。3.質(zhì)評樣品測定質(zhì)控菌株用小牛血清或肉湯溶解，按標(biāo)本種類接種各種選擇培養(yǎng)基，放適當(dāng)環(huán)境培養(yǎng)。培養(yǎng)分離病原菌，依據(jù)病原菌種類進(jìn)行判定和耐藥表型檢測，并依據(jù)質(zhì)控要求，病原菌進(jìn)行藥敏試驗(重復(fù)2次)。4.填寫報表或網(wǎng)上回報填寫報表時應(yīng)按要求逐項填寫，字跡清楚整齊。填寫完后再次查對，以防筆誤、樣本號次序錯誤等。然后則測定者、室責(zé)任人簽字。5.結(jié)果存檔填寫完后復(fù)印或?qū)⒕W(wǎng)頁另存，一份寄出，一份存檔，以備核查。檢驗科微生物室專家講座第19頁室間質(zhì)評評價方法1.單項PT值評分標(biāo)準(zhǔn)每一批號每一項目結(jié)果在允許范圍內(nèi)時，測定結(jié)果合格，得分為100%，若在允許范圍外時，測定結(jié)果不合格，得分為0%。單個項目標(biāo)得分計算公式為：(該項目標(biāo)合格結(jié)果數(shù)÷該項目標(biāo)總測定樣本數(shù))×100%。合格：該項目標(biāo)測定成績≥80%

不合格：該項目標(biāo)測定成績≤80%2.總項目標(biāo)PT值評分標(biāo)準(zhǔn)總項目標(biāo)計算公式為：

(總項目標(biāo)合格結(jié)果數(shù)÷總項目標(biāo)總測定樣本數(shù))×100%

合格：總項目標(biāo)測定總分≥80%

不合格：總項目標(biāo)測定總分≤80%3.部臨檢中心給參加試驗室發(fā)證書要求合格證書：每年每個專業(yè)參加2次或3次以上，不得缺席，每次有五個調(diào)查樣本。每次總項目標(biāo)測定總分≥80%；頒發(fā)合格證書。參加證書：不符合合格證書要求和標(biāo)準(zhǔn)均頒發(fā)參加證書。注意：若失控，應(yīng)將調(diào)查全部失控原因及相關(guān)糾正辦法，并做好統(tǒng)計，上報科質(zhì)量控制小組和科主任，由科主任簽字后，質(zhì)控結(jié)果歸檔保留。檢驗科微生物室專家講座第20頁1.患者準(zhǔn)備2.標(biāo)本采集3.標(biāo)本保留與送檢4.驗收和登記5.標(biāo)本正確評定

三、試驗室前質(zhì)量控制檢驗科微生物室專家講座第21頁1.患者準(zhǔn)備①精神原因：擔(dān)心、情緒激動可影響神經(jīng)內(nèi)分泌功效，致使白細(xì)胞、血糖、乳酸、非酯化脂肪酸升高，在采集血液標(biāo)本前醫(yī)生或護(hù)士應(yīng)向患者解釋采集標(biāo)本目標(biāo)、方法及注意事項，讓患者克服擔(dān)心情緒。②飲食：一些血液成份受飲食影響較大，護(hù)士在標(biāo)本采集前要告訴患者明確禁食時間及禁食內(nèi)容，以防止飲食原因影響檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性。如血脂檢測最少兩周內(nèi)保持普通飲食，患者應(yīng)在采血前24h禁食高脂肪飲食，12h禁食空腹采血，且前1d晚禁止大量飲酒。③運動：強烈肌肉運動顯著影響體內(nèi)代謝，丙酮酸、乳酸可升高，對紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白測定顯著影響，可造成假性升高。住院患者可在起床前抽血，慌忙起床到門診患者應(yīng)最少休息15min后采血。④藥品：藥品對血液成份影響是一個十分復(fù)雜問題。采集標(biāo)本應(yīng)盡可能選擇在未使用各種藥品前。如患者長久服用藥品，在選擇與解釋結(jié)果時，必須考慮藥品影響。

檢驗科微生物室專家講座第22頁2.標(biāo)本采集----標(biāo)本質(zhì)量控制采集標(biāo)準(zhǔn)：捕捉病原菌并保留其活性，以提升檢出率，盡可能防止非病原菌污染和干擾。標(biāo)本采前集準(zhǔn)備：向臨床提供標(biāo)本采集手冊，對搜集和運輸標(biāo)本容器控制，無菌、不易碎、足夠大，防止用木質(zhì)棉拭子（因為棉中所含脂肪酸以及從木棒中滲出樹脂和甲醛對細(xì)菌有抑制作用）對細(xì)菌有毒害。檢驗科微生物室專家講座第23頁3.正確運輸和保留方式需進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測全部標(biāo)本，最好在搜集后2h內(nèi)送到試驗室。量少標(biāo)本在采集后15-30分鐘內(nèi)送檢。對環(huán)境敏感細(xì)菌包含志賀氏菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌（對低溫敏感）等均應(yīng)馬上處理。通慣用于細(xì)菌學(xué)檢驗標(biāo)本在4°C存放不超出24h，而病毒檢測標(biāo)本可于4°C存放2-3天。檢驗科微生物室專家講座第24頁4.標(biāo)本驗收仔細(xì)查對，標(biāo)本標(biāo)識是否與申請單一致和唯一，對不合格標(biāo)本要拒收。檢驗科微生物室專家講座第25頁標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)錯誤標(biāo)簽標(biāo)本泄露，標(biāo)本顯著被污染拭子上標(biāo)簽干掉或者標(biāo)本量不夠標(biāo)本不適合所要求試驗運輸標(biāo)本時間過長或所用運輸培養(yǎng)基不適當(dāng)檢驗科微生物室專家講座第26頁5.標(biāo)本評定—有可靠標(biāo)本質(zhì)量評價方法痰標(biāo)本中>10個上皮細(xì)胞/LP、<25個WBC/LP為不合格標(biāo)本有培養(yǎng)價值糞便標(biāo)本：涂片鏡檢WBC>5個/HP，未經(jīng)抗菌藥品治療連續(xù)性腹瀉患者糞便傷口標(biāo)本：如出現(xiàn)上皮細(xì)胞，提醒標(biāo)本已受皮膚菌群污染，高倍視野中超出5個鱗狀上皮細(xì)胞傷口標(biāo)本不適合做厭氧培養(yǎng)檢驗科微生物室專家講座第27頁血液細(xì)菌培養(yǎng)臨床上疑為敗血癥、膿毒血癥或其它血流感染患者，需做血液細(xì)菌培養(yǎng)以明確病原。及時、準(zhǔn)確地從患者血液中分離出病原菌，才能正確實施有效地抗菌治療，從而有利于提升治愈率和降低醫(yī)療費用。

1.采血時機(jī)應(yīng)在用抗菌素治療前,最好在患者發(fā)冷發(fā)燒前半小時采血為宜。2.采血次數(shù)與間隔急性感染患者：從兩臂分別采2份血樣（兩套）。感染性心內(nèi)膜炎患者：24h內(nèi)采血3次,每次間隔不少于30分鐘。發(fā)燒原因不明患者：24～48h后可再采血2次,間隔不少于60分鐘。檢驗科微生物室專家講座第28頁血液細(xì)菌培養(yǎng)3.血培養(yǎng)采血方法、量、消毒與送檢采血方法：不要與血氣和血沉標(biāo)本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口采血。采血量-最主要血液和瓶中液體百分比應(yīng)為1:10，成人8～10ml、小兒2～5ml；血量不足-先需氧瓶，剩下血接種厭氧瓶。為預(yù)防污染正確皮膚消毒尤其主要！按照規(guī)范執(zhí)行。亞急性感染性心內(nèi)膜炎、人工瓣膜：主要病原菌是皮膚正常菌群，應(yīng)自靜脈，而不是留置導(dǎo)管內(nèi)采血。標(biāo)本馬上送檢，不然室溫放置。檢驗科微生物室專家講座第29頁呼吸道標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)----痰采集方法自然咳痰：必須用清水漱口3次，應(yīng)包含咽喉部，馬上用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養(yǎng)基中；支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，提議直接種入輸送培養(yǎng)基處理痰首先用滅菌生理鹽水將痰液洗3次，然后將痰塊打壞，或加入等量10g/L胰蛋白酶將痰塊消化后再接種。合格標(biāo)本

外觀為膿痰、粘液、血，涂片鏡檢<10個上皮細(xì)胞/LP、>25個WBC/LP為合格標(biāo)本。檢驗科微生物室專家講座第30頁呼吸道標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本留取質(zhì)量好壞直接影響到對呼吸道病原學(xué)診療標(biāo)本采集要盡可能降低上呼吸道正常菌群干擾應(yīng)在用藥前或停藥1天后留取標(biāo)本。檢驗科微生物室專家講座第31頁泌尿道標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)在用藥前或停藥5天后留取標(biāo)本,并使尿液在膀胱內(nèi)停留6～8h以上。盡可能防止或降低尿道口正常菌群干擾。清潔中段尿、導(dǎo)尿?qū)Ч苣?、?jīng)恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內(nèi)尿液，送檢標(biāo)本以晨起第一次尿液為佳尿量不宜太多，試管塞子與尿液不應(yīng)直接接觸留取導(dǎo)尿管尿要排空導(dǎo)尿管內(nèi)陳舊尿液，倘留置尿管超出三天應(yīng)防止采取。標(biāo)本采集后馬上送檢，不能馬上送檢者，可暫存4℃冰箱，但保留不超出8h檢驗科微生物室專家講座第32頁糞便標(biāo)本培養(yǎng)應(yīng)在發(fā)病早期而且盡可能在用抗生素治療前采集，稀便不少于1ml，固體便不少于1克，無便患者可用直腸拭子采集標(biāo)本。要挑取含膿、黏液、血等病理改變或水樣糞便送檢。直腸拭子采樣量要足夠，拭子上肉眼應(yīng)可見糞便。注意事項：⑴即使糞便標(biāo)本本身含很多細(xì)菌但也要用無菌容器。⑵厭氧細(xì)菌（難辯梭菌）培養(yǎng)標(biāo)本應(yīng)盡可能降低與空氣接觸。⑶注意挑取膿血便或粘液便做培養(yǎng)⑷要進(jìn)行分區(qū)劃線。如圖所表示。檢驗科微生物室專家講座第33頁分泌物培養(yǎng)1.對開放性病灶采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部分泌物，也可取感染部位下組織送檢。2.閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉膿腫常采取穿刺或引流方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在可能。不能及時送檢應(yīng)應(yīng)用輸送培養(yǎng)基。檢驗科微生物室專家講座第34頁膿液標(biāo)本要盡可能防止病灶表面細(xì)菌污染。開放性膿腫，采樣前無菌鹽水沖洗傷口，拭去表面污染膿液，挑取病灶深部膿液；封閉性膿液，嚴(yán)格病灶皮膚或黏膜表面消毒后用無菌干燥注射器穿刺抽取，置無菌試管內(nèi)送檢，或切開排膿時用無菌拭子采集深部膿液。檢驗科微生物室專家講座第35頁厭氧菌和傷口標(biāo)本厭氧菌標(biāo)本隔絕空氣-氧對厭氧菌有毒性作用液狀標(biāo)本應(yīng)用注射器抽取密封送檢分泌物標(biāo)本最好床邊采集床邊接種；另置厭氧環(huán)境送檢（輸送培養(yǎng)基）傷口標(biāo)本在傷口切開排膿時留取標(biāo)本不能在傷口消毒清洗后留取標(biāo)本盡可能采集傷口深部膿汁送檢檢驗科微生物室專家講座第36頁腦脊液標(biāo)本直接涂片：革蘭染色、抗酸染色、印度墨汁染色無菌采集技術(shù)：防止標(biāo)本污染及患者被感染病毒培養(yǎng)標(biāo)本：置4℃保留分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本：2mL以上，置4℃保留細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本置35℃保留檢驗科微生物室專家講座第37頁種類和步驟多（細(xì)菌判定、藥敏、培養(yǎng)基、生化管、儀器、稀釋液）包括知識面廣復(fù)雜性高需要強烈責(zé)任感四、微生物試驗分析中質(zhì)量控制檢驗科微生物室專家講座第38頁常規(guī)試驗質(zhì)量控制-天天做（質(zhì)控菌株）觸酶試驗：3％H2O2每三天更換一次血漿凝固酶試驗：人血漿或商品乳膠試劑氧化酶試驗：1％鹽酸四甲基對苯胺水溶液浸泡厚濾紙，室溫吹干壓成小紙片，置含干燥劑容器－20℃保留，或買商品制劑β－內(nèi)酰胺酶：頭孢硝噻吩(Nitrocefin)為底物，適于測試嗜血桿菌、淋球菌、卡他莫拉菌、腸球菌革蘭染色：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色；另涂片厚度、染色和脫色時間、染料沉渣等也影響染色質(zhì)量檢驗科微生物室專家講座第39頁培養(yǎng)基質(zhì)量控制普通性狀：①外觀：透明、清亮、無混濁、無沉淀，顏色符合要求，表面濕潤但無水汽、平整、光潔無凹坑和氣泡。整塊平板厚薄均勻。②厚度：普通厚度在3mm，但MH平板厚度≥4mm。斜面長度≤試管長度2/3。③pH是細(xì)菌生長主要條件之一，合格培養(yǎng)基pH應(yīng)在要求值上下0.2范圍內(nèi)。無菌試驗：新制備或新買培養(yǎng)基在使用前要隨機(jī)抽取一定數(shù)量樣品作無菌試驗。購置培養(yǎng)基要有質(zhì)量確保如合格證實等文件；若無質(zhì)量確保需檢測對應(yīng)性能。檢驗科微生物室專家講座第40頁培養(yǎng)基質(zhì)量控制細(xì)菌生長試驗：全部培養(yǎng)基在使用前還必須做細(xì)菌生長試驗以測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。標(biāo)準(zhǔn)菌株分2種：一個是已知可在某種培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生經(jīng)典生物學(xué)性狀，對培養(yǎng)基中某種物質(zhì)產(chǎn)生陽性反應(yīng)菌株；另一個是用已知不能在某種培養(yǎng)基上生長或?qū)ε囵B(yǎng)基中某種物質(zhì)產(chǎn)生陰性生化反應(yīng)菌株。如血瓊脂平板：乙型溶血性鏈球菌生長，β溶血；甲型鏈球菌，a溶血；巧克力瓊脂平板：流感嗜血桿菌生長良好；中國藍(lán)瓊脂平板和SS瓊脂平板：革蘭陰性菌生長，革蘭陽性菌不生長。檢驗科微生物室專家講座第41頁試劑質(zhì)控臨床微生物試驗室慣用試劑包含染色液、診療血清以及各種生化反應(yīng)試劑等。染色液及染色方法質(zhì)量控制：購置或配置染色液，每次需做好相關(guān)統(tǒng)計，如操作者和開瓶日期等；還要進(jìn)行染色步驟質(zhì)控，如革蘭染色在一張玻片上同時涂有金葡菌和大腸桿菌，以確保染色性判斷準(zhǔn)確無誤。慣用生化試劑質(zhì)控：伴隨細(xì)菌判定儀和快速微量生化判定板條普及，臨床微生物檢驗慣用生化試劑種類日趨降低，應(yīng)注意在用試劑在貯存時避光、冷藏等要求，確保試劑穩(wěn)定性。不要使用過期試劑。診療血清質(zhì)控：診療血清是一個主要細(xì)菌判定試劑，應(yīng)從有資質(zhì)生產(chǎn)單位購置。驗收時必須看清生產(chǎn)批號、血清效價、透明度與色澤。試驗中應(yīng)注意無菌操作，防止細(xì)菌污染。要經(jīng)常檢驗貯存在4℃冰箱中各種血清，若發(fā)覺混濁，出現(xiàn)絮狀，應(yīng)停頓使用。為確保血清凝集反應(yīng)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)每3個月對血清進(jìn)行一次質(zhì)控。不要使用過期血清。檢驗科微生物室專家講座第42頁紙片藥敏試驗室內(nèi)質(zhì)控基礎(chǔ)質(zhì)控：連續(xù)做30天，如失控超出3次還需繼續(xù)，如失控低于3次可改為每七天1次糾控：每七天質(zhì)控中發(fā)生失控應(yīng)糾控，方法：連續(xù)5天，天天1次，每次重復(fù)5個紙片，如找到明確失控原因，可馬上改為每七天1次，否者繼續(xù)4℃冰箱保留一周用量藥品敏感試驗是臨床微生物檢驗主要步驟之一，其結(jié)果正確是否包括治療效果好壞。檢驗科微生物室專家講座第43頁儀器質(zhì)量控制按儀器說明要求用標(biāo)準(zhǔn)菌株定時對不一樣批號試劑進(jìn)行質(zhì)控對冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本設(shè)備每日溫度、氣體濃度監(jiān)控統(tǒng)計；顯微鏡、細(xì)菌判定儀等儀器使用、保養(yǎng)、維修統(tǒng)計。以保障試驗室各種設(shè)備、儀器正常運轉(zhuǎn)。對儀器進(jìn)行性能驗證，若有兩臺以上儀器則要進(jìn)行儀器比對檢驗科微生物室專家講座第44頁細(xì)菌判定基本步驟標(biāo)本分離培養(yǎng)（這關(guān)系到整個結(jié)果可靠性）培養(yǎng)結(jié)果觀察（致病菌選擇）細(xì)菌分純、判定（天地人判定系統(tǒng)、ATB半自動微生物判定、VITEK系統(tǒng)、MicroScan自動微生物分析系統(tǒng)、Sensititre全自動微生物判定系統(tǒng)）檢驗科微生物室專家講座第45頁慣用培養(yǎng)基種類和用途血平板—普通細(xì)菌用巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍(lán)/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細(xì)菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細(xì)菌用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用檢驗科微生物室專家講座第46頁常見標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)基選擇痰-血平板、巧克力平板、（中國藍(lán)/麥康凱）放CO2環(huán)境，能分離肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌尿-血平板、（中國藍(lán)/麥康凱）定量培養(yǎng)糞便-中國藍(lán)/麥康凱平板、SS平板等能分離沙門菌、志賀菌等，匯報“未檢出XXX菌”腦脊液-血平板、巧克力平板CO2環(huán)境，能分離常見苛養(yǎng)菌（腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞李斯特菌等），常規(guī)進(jìn)行革蘭染色、墨汁染色胸腹水：血平板、巧克力、肉湯胃液、膽汁：血平板、中國蘭、肉湯真菌培養(yǎng)：沙氏培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)：厭氧血平板、中國蘭、肉湯、涂片陰拭子、膿、分泌物：血平板、中國蘭、肉湯咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中國蘭、肉湯；TB培養(yǎng)：羅氏雞蛋培養(yǎng)注：血平板和巧克力平板放置CO2培養(yǎng)箱或燭缸培養(yǎng)，其它放置普通培養(yǎng)環(huán)境檢驗科微生物室專家講座第47頁培養(yǎng)結(jié)果觀察（致病菌選擇）觀察培養(yǎng)基上是否有細(xì)菌生長觀察生長情況（是單一個細(xì)菌還是各種細(xì)菌）觀察生長細(xì)菌是否含有一些經(jīng)典特征排除污染細(xì)菌對于無菌部位所采集標(biāo)本（CSF、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液、血液、骨髓、各器官穿刺液等等），只要培養(yǎng)出細(xì)菌（排除污染）一律都視為致病菌。對于有菌部位或易被正常菌群污染標(biāo)本，培養(yǎng)出細(xì)菌后，要依據(jù)標(biāo)本不一樣，排除正常菌群后，再挑選致病菌（請看下列圖）。檢驗科微生物室專家講座第48頁無菌部位標(biāo)本檢驗科微生物室專家講座第49頁涂片染色

涂片染色：應(yīng)具備最基本兩種染色技術(shù)，即革蘭氏染色和抗酸染色。1革蘭染色：革蘭染色匯報必須包含染色反應(yīng)或微生物種類和類別，描述物種形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。2.抗酸染色：抗酸染色匯報應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，匯報中應(yīng)以加號表達(dá)標(biāo)本中抗酸桿菌存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不經(jīng)典抗酸桿菌+，提議再送標(biāo)本；不能匯報找到結(jié)核桿菌但可匯報未找到結(jié)核桿菌。檢驗科微生物室專家講座第50頁檢驗科微生物室專家講座第51頁細(xì)菌判定檢驗科微生物室專家講座第52頁血清學(xué)試驗?zāi)c道致病菌生化特征符合前提下必須有血清學(xué)試驗作最終確認(rèn)，基層細(xì)菌室應(yīng)具備1-3項血清試劑。1.志賀氏菌多價和單價凝集血清：2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清4.耶爾森氏菌凝集血清檢驗科微生物室專家講座第53頁真菌判定1．每一基層試驗室必須開展真菌涂片，匯報臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)區(qū)分常見絲狀真菌;區(qū)分曲菌或毛霉菌。2．開展酵母樣真菌分離培養(yǎng)，應(yīng)具備最基本沙氏培養(yǎng)基或用顯色培養(yǎng)基，判別白念和非白念，隱球菌等。3.有條件試驗室應(yīng)開展非培養(yǎng)判定方法，如-D葡聚糖檢測。檢驗科微生物室專家講座第54頁檢驗科微生物室專家講座第55頁檢驗科微生物室專家講座第56頁檢驗科微生物室專家講座第57頁檢驗科微生物室專家講座第58頁檢驗科微生物室專家講座第59頁檢驗科微生物室專家講座第60頁抗菌藥品敏感性試驗-慣用方法擴(kuò)散試驗diffusiontest：紙片擴(kuò)散法(抑菌圈直徑)稀釋試驗dilutiontest：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、最小抑菌濃度minimuminhibitoryconcentration，MICE試驗E-test自動化儀器檢測檢驗科微生物室專家講座第61頁

紙片擴(kuò)散法操作步驟制備接種物（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬㎝-H瓊脂平板上（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻）在接種好瓊脂平板上貼加紙片

孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）

苛養(yǎng)菌5％CO2孵育判度結(jié)果和解釋結(jié)果檢驗科微生物室專家講座第62頁檢驗科微生物室專家講座第63頁ESBL確認(rèn)試驗檢驗科微生物室專家講座第64頁ESBL質(zhì)控頻率篩選試驗和表型確證試驗均可每日進(jìn)行或每七天進(jìn)行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。應(yīng)該注意是：肺克700603ESBL基因在質(zhì)粒上，應(yīng)將其凍存于-60℃或以下。奇異變形桿菌ESBL監(jiān)測試驗不適用不適用Ceftriaxone>127Cefotaxime

NANAAztreonam>122Ceftazidime>1*22*Cefpodoxime稀釋法

(μg/ml)紙片擴(kuò)散法(mm)Drug檢驗科微生物室專家講座第65頁可誘導(dǎo)克林霉素耐藥(erm-介導(dǎo))常規(guī)D－試驗:陽性

15g紅霉素紙片及2g克林霉素之間距離為15-26.“DTest”

–陽性反應(yīng)

檢驗科微生物室專家講座第66頁紙片擴(kuò)散法判讀結(jié)果將游標(biāo)卡尺置于反轉(zhuǎn)平板后面，測量到最靠近整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個黑色不反光背景數(shù)英寸，并用反射光照明。假如是加血瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。假如被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素透明抑菌圈內(nèi)有沒有耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落微弱生長，遇不敏感結(jié)果需用稀釋法測定MIC法確變形桿菌(遷移生長)以及磺胺類藥品紙片法藥敏忽略薄紗樣蔓延生長，微弱生長（20%或更少），克林霉素對葡萄球菌抑菌圈內(nèi)如有薄霧狀菌苔應(yīng)匯報細(xì)菌對克林霉素耐藥,不論其是否顯示“D”抑菌圈五、試驗后質(zhì)量控制檢驗科微生物室專家講座第67頁藥敏結(jié)果結(jié)果審核S-敏感（Susceptible）：用常規(guī)用量治療有效，常規(guī)用藥時到達(dá)平均血藥濃度超出細(xì)菌MIC5倍以上。R-耐藥（Resistance）：用常規(guī)用量治療不能抑制細(xì)菌生長，MIC高于藥品在血、體液中可能到達(dá)濃度。I-中介(Intermediate)：MIC靠近血、體液中藥品濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株，藥品生理濃集部位有效(泌尿道)，加大用藥劑量可能有效。檢驗科微生物室專家講座第68頁常見細(xì)菌耐藥問題肺炎鏈球菌—PRSP腸球菌—VRE葡萄球菌—MRSA、VRSA腸桿菌屬—AmpC超級細(xì)菌—NDM-1（Ⅰ型新德里金屬－β－內(nèi)酰胺酶）以上耐藥問題都為當(dāng)前全球最關(guān)注細(xì)菌耐藥問題，也是我們在工作中要尤其注意問題檢驗科微生物室專家講座第69頁

臨床微生物試驗室匯報制度規(guī)范臨床微生物試驗室應(yīng)對不一樣細(xì)菌檢驗匯報時間和內(nèi)容應(yīng)有對應(yīng)要求，并告訴臨床各科，依此可預(yù)防不明原因匯報延遲。應(yīng)分兩種匯報形式：危重感染匯報:常規(guī)匯報:檢驗科微生物室專家講座第70頁匯報規(guī)范化1.涂片匯報革蘭染色：危重匯報30－60分鐘匯報。匯報內(nèi)容應(yīng)包含染色反應(yīng)、是細(xì)菌或真菌、細(xì)菌形態(tài)。有沒有細(xì)胞內(nèi)吞嗜現(xiàn)象，有沒有菌絲?？顾崛旧簠R報抗酸染色陽性或陰性；菌量以加號表示。常規(guī)匯報24h,危重匯報1h－2ｈ。2.血液和無菌體液培養(yǎng)匯報制度實施三級匯報制度：第一級：培養(yǎng)液直接涂片結(jié)果；第二級：初步藥敏結(jié)果和平皿菌落涂片結(jié)果；第三級：正式細(xì)菌判定和藥敏匯報。檢驗科微生物室專家講座第71頁匯報規(guī)范化3.便培養(yǎng)24小時可發(fā)出初始匯報;72小時應(yīng)匯報藥敏試驗結(jié)果；依據(jù)檢測范圍匯報檢測結(jié)果，如未檢測出沙門菌、志賀菌。錯誤匯報:未見到致病菌4.尿培養(yǎng)：可在24小時匯報初始結(jié)果，包含菌落計數(shù)和可能細(xì)菌種類，如氧化酶陰性革蘭陰性桿菌；金黃色葡萄球菌等。5.痰培養(yǎng)：24小時初始匯報，匯報內(nèi)容包含痰標(biāo)本是否合格，優(yōu)勢細(xì)菌，金葡菌、銅綠假單孢菌等特征顯著細(xì)菌判定結(jié)果。6.分泌物匯報：24h初始匯報，有沒有細(xì)菌生長；革蘭陽性或陰性細(xì)菌或特征顯著細(xì)菌名稱；依據(jù)涂片結(jié)果推測致病菌。檢