藥實驗四線粒體和細胞核的制備與觀察

藥實驗四線粒體和細胞核的制備與觀察第1頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日二、實驗原理線粒體是真核細胞特有的進行能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。將動植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻的懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第2頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日

差速離心技術(shù)：利用細胞核與線粒體在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將細胞核與線粒體逐級分離出來。懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃-4℃，避免酶失活。第3頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日細胞器標記酶的測定是評價細胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。第4頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日

詹納斯綠B是一種活體染料，能對動植物的細胞或組織在活體狀態(tài)下進行無毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染部分本身具有陽離子或陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆積下來。染色法可以顯示出活細胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實性，且不影響細胞的生命活動。

Gimesa是一種復(fù)合染料，即為酸性染料與堿性染料的結(jié)合物。在水溶液中電離為帶正電和負電的染料離子。第5頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日三、實驗材料、用品1.器材：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。2.材料：

兔肝臟,

玉米黃化苗第6頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日3.試劑：

(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4)

(2)

1%詹納斯綠B(JanusgreenB)染液。(3)

姬姆薩染液（Giemsa）。(4)

1/15mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）(5)

卡諾（Cornay）固定液。(6)生理鹽水第7頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日四、實驗步驟(一)兔肝細胞線粒體及細胞核的分離（動物材料）1.制備肝細胞勻漿：實驗前將白兔空腹12小時，脫臼處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織0.3g，剪碎；用預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后加1.5ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分數(shù)次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，肝勻漿用雙層紗布過濾(濾液制兩張涂片①②).第8頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日第9頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日涂片過程：第10頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日3.分離物鑒定：（1）

細胞核：將涂片①③（不加蓋玻片）自然干燥后加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水，用顯微鏡（40×）檢查，細胞核呈紫紅色，混雜的細胞質(zhì)為淺藍色碎片。（2）

線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上，得涂片②④，勿太密。滴加1-2滴1%詹納斯綠B溶液染色，10分鐘后加蓋玻片，吸水紙吸走多余染料，用光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。第11頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日(二)玉米線粒體及細胞核的分離（植物材料）從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能研究外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因――線粒體DNA等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差數(shù)離心。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價陽離子，Ca2+除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。第12頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日1.試劑1）分離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA。2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）。3）20%NaClO溶液。4）1%詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2.器材剪刀，漏斗，研缽，紗布，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。第13頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日3.實驗方法1）剪取1～2cm長的幼苗黃化苗0.5g，剪碎；加2.0ml預(yù)冷的分離介質(zhì)，冰浴上研磨成勻漿。2）勻漿用雙層紗布過濾(濾液制兩張涂片①).3）濾液700g離心10分鐘，除去核和雜質(zhì)沉淀。4）上清夜10000g離心15分鐘，沉淀為線粒體制涂片②5）涂片①②未干時，立即滴加1%詹納斯綠B染液，染色10分鐘，蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。第14頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日五、實驗結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。第15頁，共16頁，2023年，2月20日，星期日六、實驗報告1.分別描述2張細胞核涂片的結(jié)果(如平均每個視野中所見完整的細胞核數(shù)量，完整的細胞或帶有殘留細胞質(zhì)的細胞核的約占多少等)2