轉(zhuǎn)基因植物的鑒定

轉(zhuǎn)基因植物的鑒定第1頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化后，外源基因是否進(jìn)入植物細(xì)胞，進(jìn)入植物細(xì)胞的外源基因是否整合到植物染色體上，整合的方式如何，整合到染色體上的外源基因是否表達(dá)，這一系列的問(wèn)題仍需回答，只有獲得充分的證據(jù)后才可認(rèn)定被檢測(cè)的材料是轉(zhuǎn)基因的。第2頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日目前認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物的證據(jù)應(yīng)有以下幾點(diǎn)：①要有嚴(yán)格的對(duì)照（包括陽(yáng)性及陰性對(duì)照）；②轉(zhuǎn)化當(dāng)代要提供外源基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)、物理數(shù)據(jù)（southern雜交，northern雜交，western雜交）與表型數(shù)據(jù)（酶活性分析或其它）；③提供外源基因控制的表型性狀證據(jù)（如抗蟲、抗病等）；④根據(jù)該植物的繁殖方式（有性繁殖還是無(wú)性繁殖）提供遺傳證據(jù)。有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性狀傳遞給后代的證據(jù)，無(wú)性繁殖作物有繁殖一代穩(wěn)定遺傳的證據(jù)。第3頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日外源基因整合的鑒定證明外源基因在植物染色體上整合的最可靠的方法是DNASouthern分子雜交，只有經(jīng)過(guò)分子雜交鑒定過(guò)的植物才可以稱為轉(zhuǎn)基因植物。第4頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日核酸分子雜交是指非同一分子來(lái)源但具有互補(bǔ)序列（或某一區(qū)段互補(bǔ)）的兩條多核苷酸鏈，通過(guò)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。若其中的一條鏈被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過(guò)某種特定方法檢出，即成為所謂的探針。第5頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日探針與其互補(bǔ)的核苷酸序列雜交后，雜交體也就帶上了同樣標(biāo)記，可被檢測(cè)出來(lái)。這樣，以特定的已知核苷酸序列做探針，就可以在諸多的核苷酸序列中，通過(guò)雜交探測(cè)出與其互補(bǔ)的序列，因而分子雜交是進(jìn)行核酸序列分析，重組子鑒定及檢測(cè)外源基因整合表達(dá)的強(qiáng)有力手段。第6頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日它具有靈敏性高（可檢出10-12g，即1pgDNA樣品）、特異性強(qiáng)（可鑒別出20個(gè)堿基對(duì)左右的同源序列）的特點(diǎn)，是當(dāng)前鑒定外源基因整合及表達(dá)的權(quán)威方法。根據(jù)雜交時(shí)所用的方法，核酸分子雜交又可分為印跡雜交、斑點(diǎn)（dot）雜交、狹槽（slot）雜交和細(xì)胞原位（insitu）雜交等。第7頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日鑒定轉(zhuǎn)基因植株所涉及到的核酸分子雜交有Southern雜交及Northern雜交。Southern雜交是以DNA或RNA為探針，檢測(cè)DNA鏈，不僅可鑒定外源基因的整合，還可初步鑒定插入的拷貝數(shù)。第8頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）的簡(jiǎn)稱。它模擬DNA聚合酶在生物體內(nèi)的催化作用，根據(jù)檢測(cè)的目的片段及一定的原則設(shè)計(jì)引物，與模板DNA經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三步驟的數(shù)個(gè)循環(huán)，對(duì)特異DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，可以在一只小小的離心管中幾小時(shí)內(nèi)使目的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。第9頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日PCR檢測(cè)所需的模板量?jī)H為10ng以內(nèi)，而且粗提的DNA就可以得到良好的擴(kuò)增效果，因而這一技術(shù)的出現(xiàn)為外源基因整合的檢測(cè)提供了便利條件，尤其是在轉(zhuǎn)化材料少又需及早檢測(cè)的時(shí)候。但由于PCR擴(kuò)增十分靈敏，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增，因此檢測(cè)的只是初步結(jié)果。第10頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日外源基因轉(zhuǎn)錄水平的鑒定基因表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄及翻譯兩階段，轉(zhuǎn)錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過(guò)程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白質(zhì)的過(guò)程，檢測(cè)外源基因的表達(dá)就是檢測(cè)特異mRNA及特異蛋白質(zhì)的生成。所以基因表達(dá)檢測(cè)分為兩個(gè)水平：即轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)特異mRNA的檢測(cè)和翻譯水平上對(duì)特異蛋白質(zhì)的檢測(cè)。第11頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日轉(zhuǎn)錄水平上的檢測(cè)主要方法是Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測(cè)RNA鏈。和Southern雜交相同，Northern雜交包括斑點(diǎn)雜交和印跡雜交。第12頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日也可用RT-PCR（reversetranscribedPCR）方法檢測(cè)外源DNA在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其原理是以植物總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)PCR擴(kuò)增。如果從細(xì)胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴(kuò)增條帶，則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。此法簡(jiǎn)單、快速，但對(duì)外源基因轉(zhuǎn)錄的最后決定，還需與Northern雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合。第13頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)表達(dá)蛋白的檢測(cè)方法有三種：①生化反應(yīng)檢測(cè)法：主要通過(guò)酶反應(yīng)來(lái)檢測(cè)；②免疫學(xué)檢測(cè)法：通過(guò)目的蛋白（抗原）與其抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，具體方法有Western雜交、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）及免疫沉淀法；③生物學(xué)活性的檢測(cè)。第14頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日Western雜交是將聚丙烯酰胺凝膠（SDS）電泳分離抗原（Antigen）固定在固體支持物上（如硝酸纖維素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移率不同，據(jù)此可確定特定的抗原存在與否以及相對(duì)豐度，或者蛋白質(zhì)是否遭到降解等。蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)到NC膜，放在蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，溫育，以封閉非特異性位點(diǎn)，然后用含有放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的特定抗體雜交，抗原-抗體結(jié)合，再通過(guò)放射性自顯影或顯色觀察。第15頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期日ELISA與經(jīng)典的同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的液－液抗原－