肺炎鏈球菌的分離和鑒定

肺炎鏈球菌的分離和鑒定第1頁/共61頁概述

肺炎鏈球菌（S.pneumoniae），俗稱肺炎球菌（pneumococcus）。經(jīng)常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成帶菌狀態(tài)。當機體免疫力下降時才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒、老年體弱者易發(fā)生肺炎鏈球菌性肺部感染。第2頁/共61頁

肺炎鏈球菌不產(chǎn)生外毒素，主要靠莢膜侵襲力致病。肺炎鏈球菌主要引起人類大葉性肺炎，肺炎后可繼發(fā)胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻竇炎、支氣管炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和敗血癥等。

第3頁/共61頁

細菌學檢驗不僅對疾病的病原學診斷有重要價值，同時對臨床治療的藥物選擇也具有十分重要意義。第4頁/共61頁

一、生物學性狀第5頁/共61頁1.形態(tài)與染色肺炎鏈球菌革蘭染色呈陽性。球形或矛頭狀，成雙排列，少呈鏈狀。在組織中可形成莢膜（人工培養(yǎng)莢膜逐漸消失），無鞭毛及芽孢。第6頁/共61頁第7頁/共61頁第8頁/共61頁第9頁/共61頁2.培養(yǎng)特點（1）培養(yǎng)基肺炎鏈球菌對營養(yǎng)要求較高，需采用質(zhì)量好的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)和新鮮血液（5％馬血或羊血）。瓊脂濃度可適當下降至1％～1.2％，有利于肺炎鏈球菌的生長。第10頁/共61頁（2）分離培養(yǎng)1）標本處理

及時將采集標本接種到適當?shù)呐囵B(yǎng)基上是提高分離率的前提。因為，肺炎鏈球菌對干燥、對寒冷的抵抗力均較弱，在標本離開機體暴露于外界復雜的環(huán)境中，其存活率十分低，不及時接種適當培養(yǎng)基是導致分離率低的主要原因。第11頁/共61頁2）選擇性分離培養(yǎng)基培養(yǎng)基中添加5μg/ml慶大霉素有利于肺炎鏈球菌的分離。第12頁/共61頁3）培養(yǎng)環(huán)境

5～10％CO2、35℃培養(yǎng)24～48h。第13頁/共61頁（3）肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌形成扁平、中間有凹陷的典型菌落，少數(shù)菌可呈粘液型菌落。第14頁/共61頁第15頁/共61頁第16頁/共61頁第17頁/共61頁肺炎鏈球菌第18頁/共61頁肺炎鏈球菌第19頁/共61頁第20頁/共61頁肺炎鏈球菌第21頁/共61頁3.抗原結(jié)構(gòu)（1）種屬特異性抗原：為菌體多糖抗原，存在于肺炎鏈球菌的細胞壁。（2）型特異性抗原：是存在于肺炎鏈球菌莢膜中的一種多糖多聚體，可溶于水，據(jù)此抗原可將肺炎鏈球菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等個型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最強。（3）菌體核蛋白抗原：存在于菌體深部，為蛋白質(zhì)，無特異性。第22頁/共61頁二、肺炎鏈球菌鑒定肺炎鏈球菌的鑒定，主要應與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗、菊糖發(fā)酵和optochin試驗最為常用。必要時可作小鼠毒力試驗加以鑒別。在上述試驗中，肺炎鏈球菌均應陽性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。必要時可用特異性單克隆乳膠或自動化儀器等相應鑒定卡作鑒定。第23頁/共61頁肺炎鏈球菌鑒定要點

革蘭陽性雙球菌，矛頭狀，不呈鏈；血平皿菌落呈草綠溶血，濕潤，菌落表面無小白點；培養(yǎng)時間長出現(xiàn)臍窩狀；膽汁溶解試驗陽性；乳膠單克隆抗體凝集陽性。第24頁/共61頁口腔鏈球菌第25頁/共61頁第26頁/共61頁1.溶血性檢查肺炎鏈球菌在厭氧或二氧化碳環(huán)境中溶血能力大大加強，草綠色溶血環(huán)很大，可與其他草綠色鏈球菌相區(qū)別。第27頁/共61頁2.Optochin(OP)敏感試驗

optochin即乙基氫化叩卟啉，因結(jié)構(gòu)似于奎寧，故又稱為乙基氫化羥基奎寧。該藥對肺炎鏈球菌的作用機制是干擾其葉酸的合成。

optochin敏感試驗方法似藥敏試驗。挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上含5μg/片的optochin紙片，置5~10%CO2的大氣中（或燭缸），35℃孵育過夜。抑菌環(huán)直徑>=14mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑<14mm時參照膽汁溶菌試驗。肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%）小于12mm。

第28頁/共61頁

也有例外，我們在實際工作中檢出過耐optochin的肺炎鏈球菌，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的緩癥鏈球菌和部分口腔鏈球菌對optochin的抑菌環(huán)直徑>=14mm。應注意鑒別。但大多數(shù)肺炎鏈球菌對苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌對OX耐藥。這可作為輔助鑒別點。第29頁/共61頁第30頁/共61頁肺炎鏈球菌第31頁/共61頁肺炎鏈球菌第32頁/共61頁第33頁/共61頁第34頁/共61頁3.膽汁溶菌試驗

自溶酶是一種L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切斷肽聚糖上L-丙氨酸與N-乙酰胞壁酸間的連接鍵，從而破壞細胞壁，使菌溶解。自溶酶在菌生長的穩(wěn)定期被激活，也可被膽汁或膽鹽等活性物質(zhì)激活，從而促進培養(yǎng)物中的菌體溶解。肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗為陽性，甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗為陰性。第35頁/共61頁

（1）試管法:

取新鮮培養(yǎng)物分裝于兩支試管內(nèi)（每支1ml），其中一支加入10%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml，另一支加入無菌鹽水兩滴（對照），15min后，陽性者細菌被溶解，試管內(nèi)液體呈透明狀，陰性者無變化。第36頁/共61頁第37頁/共61頁

（2）平皿法:

加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被檢菌菌苔上，15min后，陽性者細菌菌苔被溶解，陰性者無變化。試驗應有已知肺炎鏈球菌作陽性對照。第38頁/共61頁第39頁/共61頁第40頁/共61頁膽溶陰性第41頁/共61頁4.乳膠凝集試驗

結(jié)果準確、快速、特異性高。第42頁/共61頁第43頁/共61頁第44頁/共61頁5.莢膜腫脹試驗

取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量美藍液混合后加蓋片，室溫10~20min后，用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周圍繞有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽性?？捎糜诜窝祖溓蚓姆中?。第45頁/共61頁6.凝集試驗

包括血清凝集試驗、SPA（葡萄球菌蛋白A）協(xié)同凝集試驗、反向乳膠凝集試驗等方法。第46頁/共61頁表1非β溶血鏈球菌的鑒別————————————————————————————————————菌種Optochin膽汁膽汁6.5%NaCl吡咯烷衛(wèi)星現(xiàn)象CAMP血清群敏感溶菌七葉苷肉湯酮酶————————————————————————————————————肺炎鏈球菌++——————牛鏈球菌——+————D無乳鏈球菌———d——+B草綠色鏈球菌————————營養(yǎng)變異鏈球菌————++——————————————————————————————————————*d.不同菌株第47頁/共61頁三、肺炎鏈球菌的藥敏試驗

K-B法：采用Mueller-Hinton瓊脂＋5％羊血培養(yǎng)基。直接菌落懸液法(0.5麥氏單位菌液，在15分鐘內(nèi)接種完)作為接種液。稀釋法：包括瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和Etest法。培養(yǎng)條件：為35℃、5％CO2培養(yǎng)20～24小時。質(zhì)控菌株ATCC49619。第48頁/共61頁1.肺炎鏈球菌的耐藥機制青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）的耐藥機制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，因為PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位，改變后使PBP與青霉素G的結(jié)合力下降；青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）始發(fā)現(xiàn)于1967年；多重耐藥肺炎鏈球菌（MDR）1977年首次在南非爆發(fā)流行。第49頁/共61頁

肺炎鏈球菌對奎諾酮類抗生素的耐藥主要是由該菌產(chǎn)生拓撲酶所致。第50頁/共61頁

肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制主要為靶位的改變，即核糖體50S亞單位改變所致，由ersB(erythromycinresistancemethylase)基因介導，其耐藥表型為MLS，即對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽霉素B交叉耐藥。另一耐藥機制為主動外排系統(tǒng)，由mefA基因介導，其耐藥表型為M，即對14元環(huán)（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素、氟紅霉素）、15元環(huán)（阿奇霉素）大環(huán)內(nèi)酯類低水平耐藥，而對16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類（羅他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麥迪霉素、麥白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米歐卡霉素）、林可霉素和鏈陽霉素B敏感。第51頁/共61頁

耐青霉素肺炎鏈球菌的傳播主要有兩種途徑:

(1)克隆傳播，是耐藥菌株從一個國家或地區(qū)傳播到另一個國家或地區(qū)。

(2)基因水平轉(zhuǎn)移，是把耐藥基因轉(zhuǎn)移到敏感菌株中。

過度使用抗生素是耐藥菌株傳播的危險因素。一般認為在抗生素的壓力選擇下，敏感菌株被殺死，耐藥菌株確能生存下來,或者其他相關(guān)鏈球菌耐藥的DNA序列通過基因轉(zhuǎn)移在肺炎鏈球菌之間傳播。研究發(fā)現(xiàn)證實兒童鼻咽部存在“隱匿性耐藥克隆株”。

隨著我國兒童β-內(nèi)酰胺類抗生素大量使用,可以預計不久的將來,不敏感的肺炎鏈球菌將會急劇增加。第52頁/共61頁2.耐青霉素肺炎鏈球菌的檢測

紙片擴散法對β內(nèi)酰胺類藥物結(jié)果的準確性不夠，用1μg/片苯唑西林(OX)篩選肺炎鏈球菌對青霉素耐藥時，當抑菌環(huán)直徑小于20mm時，就必須做稀釋法證實是耐藥。第53頁/共61頁第54頁/共61頁3.肺炎鏈球菌的藥敏報告用1ug/片苯唑西林紙片測試青霉素敏感性，當抑菌環(huán)≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可報告青霉素敏感。并同時可報告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感