重組克隆的篩選與鑒定

內(nèi)容提要第一節(jié)載體表型選擇法第二節(jié)DNA電泳檢測法第三節(jié)核酸雜交檢測法第四節(jié)免疫化學(xué)檢測法第五節(jié)轉(zhuǎn)譯篩選法第六節(jié)真核重組基因的選擇方法現(xiàn)在是1頁\一共有166頁\編輯于星期日一般克隆與篩選策略現(xiàn)在是2頁\一共有166頁\編輯于星期日第一節(jié)載體表型選擇法根據(jù)載體提供的表型進行選擇的方法：抗生素抗性基因的插入失活選擇法-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)選擇法現(xiàn)在是3頁\一共有166頁\編輯于星期日一般原理一種利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，來篩選重組子的方法。通常外源DNA插入的位點設(shè)計在特定基因上，一旦外源DNA插入，該基因就被破壞而失去活性。由此來判斷載體上是否帶有外源DNA。一、插入失活法的原理現(xiàn)在是4頁\一共有166頁\編輯于星期日二、利用抗生素抗性基因：pBR322以pBR322為例，說明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。1.原理在pBR322上有多個單一的限制酶位點，如BamHI位點，恰好在一個四環(huán)素抗性基因內(nèi)。如果有外源DNA插入BamHI位點，那么涉及四環(huán)素抗性的基因就損壞，因此，帶有重組pBR322質(zhì)粒的細胞，仍對氨芐青霉素有抗性，但對四環(huán)素的抗性消失（敏感）。現(xiàn)在是5頁\一共有166頁\編輯于星期日2.篩選的方法①轉(zhuǎn)化細胞涂布于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。②用一個牙簽接觸培養(yǎng)基的表面，將沾有不同菌落的牙簽，放到另一含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基表面接觸一下。③適溫培養(yǎng)，有的克隆生長，有的不生長。④根據(jù)不會生長的位置，再回到帶氨芐的培養(yǎng)基上去找那些原始的克隆。⑤這些克隆因為喪失了對四環(huán)素的抗性，就是含有重組pBR322質(zhì)粒的重組子?，F(xiàn)在是6頁\一共有166頁\編輯于星期日圖pBR322的結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)在是7頁\一共有166頁\編輯于星期日3.抗菌素標(biāo)記的選擇（1）Ampr氨芐青霉素抗性基因產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使藍灰色的碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色。Ampr有PstI、ScaI等多個插入位點。（2）四環(huán)素抑制細菌生長，但不殺死細菌。（3）環(huán)絲氨酸殺死生長的細菌，但不殺停止生長的細菌?，F(xiàn)在是8頁\一共有166頁\編輯于星期日4.選擇的過程（1）四環(huán)素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素﹢環(huán)絲氨酸的平板，選擇重組克隆。Tetr插入失活的細菌，其生長可被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的細菌，能抗四環(huán)素，正常生長，但可被環(huán)絲氨酸殺死。現(xiàn)在是9頁\一共有166頁\編輯于星期日無環(huán)絲氨酸圖四環(huán)素抗性插入失活重組克隆現(xiàn)在是10頁\一共有166頁\編輯于星期日（2）氨芐青霉素抗性插入失活氨芐青霉素抗性基因編碼產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使藍灰色的碘-青霉素指示液褪色。如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青霉素指示液褪色呈藍灰色。據(jù)此選擇陽性克隆。現(xiàn)在是11頁\一共有166頁\編輯于星期日圖氨芐青霉素抗性插入失活現(xiàn)在是12頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是13頁\一共有166頁\編輯于星期日三、利用-半乳糖苷酶顯色選擇重組子的原理1.-半乳糖苷酶與LacZ基因由E.colilac操縱子上的LacZ基因編碼。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2.LacZ基因突變的LacZ基因，只編碼-半乳糖苷酶的部分肽段（氨基端）?，F(xiàn)在是14頁\一共有166頁\編輯于星期日2.培養(yǎng)基中IPTG、X-gal的作用（1）IPTG作用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷是誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)lacZ基因的表達-半乳糖苷酶。（2）X-gal作用5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作為-半乳糖苷酶水解的底物。（3）X-gal的顯色反應(yīng)β-半乳糖苷酶(四聚體)將X-gal水解成半乳糖苷和藍色的吲哚衍生物(靛藍)。在4℃藍色加深。現(xiàn)在是15頁\一共有166頁\編輯于星期日-互補作用是pUC質(zhì)粒載體的特性。pUC載體：含有LacZ基因，編碼-半乳糖苷酶的部分肽段（片段，氨基端）。受體菌：基因組中帶有突變的-半乳糖苷酶基因（缺失片段），可被IPTG誘導(dǎo)表達（只編碼-半乳糖苷酶的-肽）。載體和受體菌基因組互補：只有當(dāng)受體菌吸收了帶有LacZ基因的pUC質(zhì)粒，才能合成完整的有活性的-半乳糖苷酶。3.-互補作用現(xiàn)在是16頁\一共有166頁\編輯于星期日氨芐青霉素抗性基因LacZ基因：編碼-半乳糖苷酶的部分肽段。LacZ上有插入外源DNA的MCS位點。pUC18/19的結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)在是17頁\一共有166頁\編輯于星期日利用藍白斑法篩選pUC8/9重組子，是一種直接檢測-半乳糖苷酶活性的方法。①先將轉(zhuǎn)化子涂于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基，能合成-半乳糖苷酶。②然后再通過檢測-半乳糖苷酶的活性，來選擇重組子，如果既能抗氨芐青霉素，又能合成-半乳糖苷酶的細胞，就是重組子細胞。4.篩選的方法：藍白斑法現(xiàn)在是18頁\一共有166頁\編輯于星期日③-半乳糖苷酶分解X-gal的顯色反應(yīng)很靈敏。當(dāng)在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培養(yǎng)基中，那些能合成完整的-半乳糖苷酶的非重組子克隆，會因它能分解X-gal而變成藍色；④而重組子克隆因LacZ基因被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色?，F(xiàn)在是19頁\一共有166頁\編輯于星期日5.選擇培養(yǎng)的原理在含有X-gal和IPTG的選擇培養(yǎng)基上，載體上沒有插入片段的轉(zhuǎn)化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。平板37℃培養(yǎng)后，放于冰箱3-4小時，可使顯色反應(yīng)充分，菌落為藍色?，F(xiàn)在是20頁\一共有166頁\編輯于星期日圖-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)*-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍++藍色現(xiàn)在是21頁\一共有166頁\編輯于星期日圖LacZ插入外源DNA現(xiàn)在是22頁\一共有166頁\編輯于星期日圖白色菌落與藍色菌落的挑選現(xiàn)在是23頁\一共有166頁\編輯于星期日四、pBS重組質(zhì)粒的篩選實驗使用的載體為pBS質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化受體菌為E.coliDH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法?，F(xiàn)在是24頁\一共有166頁\編輯于星期日載體α-供體為羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。如pUC、pGEM系列載體。菌株α-受體為氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。如DH5α(LacZ△M15)、JM101~110(LacZ△M15)等?，F(xiàn)在是25頁\一共有166頁\編輯于星期日1.抗性篩選因pBS質(zhì)粒帶有Ampr基因，而外源DNA片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌后，只有帶有pBSDNA的轉(zhuǎn)化子，才能在含有Amp的LB平板上存活下來；而只帶有自身環(huán)化的外源DNA片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選?，F(xiàn)在是26頁\一共有166頁\編輯于星期日2.lacZ基因的插入失活pBS質(zhì)粒上帶有β-半乳糖苷酶基因的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。該編碼區(qū)有一個多克隆位點，但并不破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能?，F(xiàn)在是27頁\一共有166頁\編輯于星期日3.DH5α菌株E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶的C端的部分編碼序列。在各自獨立的情況下，pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時，可形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在是28頁\一共有166頁\編輯于星期日4.α-互補現(xiàn)象lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象。由α-互補產(chǎn)生的Lac+細菌較易識別，它在生色底物X-gal存在下，被IPTG誘導(dǎo)，形成藍色菌落?，F(xiàn)在是29頁\一共有166頁\編輯于星期日當(dāng)外源DNA片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點后，導(dǎo)致讀碼框架改變，表達蛋白失活，產(chǎn)生的肽段失去α-互補能力。因此，在同樣條件下，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，只能形成白色菌落?，F(xiàn)在是30頁\一共有166頁\編輯于星期日α互補作用/現(xiàn)象當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因的氨基未端編碼序列缺失的Lac-指示菌株時，能恢復(fù)β-半乳糖苷酶活性，從而在含IPTG和X-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4-氯靛藍，出現(xiàn)藍色菌落的現(xiàn)象。當(dāng)外源DNA插入pUC的MCS時，α-互補作用被破壞，在IPTG和X-gal平板上則不顯藍色而出現(xiàn)白色菌落?，F(xiàn)在是31頁\一共有166頁\編輯于星期日第三節(jié)DNA電泳檢測法PFGE現(xiàn)在是32頁\一共有166頁\編輯于星期日從轉(zhuǎn)化后的克隆（轉(zhuǎn)化子）中快速抽提重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳比較其分子量大小。插入外源DNA的重組質(zhì)粒分子量大，沒有插入外源DNA的質(zhì)粒分子量小。比較不同質(zhì)粒在凝膠中的遷移率，遷移快慢不同，即可選出重組子。一、直接電泳檢測法現(xiàn)在是33頁\一共有166頁\編輯于星期日Marker載體重組圖瓊脂糖凝膠電泳圖譜的比較已知未知現(xiàn)在是34頁\一共有166頁\編輯于星期日二、酶切產(chǎn)物電泳篩選法1.原理根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇1~2種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較DNA帶數(shù)和長度?；蛴靡环N內(nèi)切酶切下插入片段，再用另一種酶酶切這個片段，電泳后比較兩者是否符合預(yù)計的結(jié)果?，F(xiàn)在是35頁\一共有166頁\編輯于星期日圖酶切產(chǎn)物的電泳篩選現(xiàn)在是36頁\一共有166頁\編輯于星期日圖限制性內(nèi)切酶酶切圖譜現(xiàn)在是37頁\一共有166頁\編輯于星期日圖表型篩選加酶切篩選０AATTAATT現(xiàn)在是38頁\一共有166頁\編輯于星期日三、PCR擴增檢測法1.原理在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。2.過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用插入的DNA片段的引物作PCR。（3）PCR產(chǎn)物電泳檢查。（4）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。現(xiàn)在是39頁\一共有166頁\編輯于星期日第四節(jié)核酸的分子雜交核酸雜交技術(shù)由Hall、Nygaard等于70年代建立，應(yīng)用DNA或RNA探針，與靶序列在溶液中雜交，檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的核酸序列的技術(shù)。核酸雜交法利用標(biāo)記的核酸探針，與轉(zhuǎn)化細胞的DNA進行雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆?，F(xiàn)在是40頁\一共有166頁\編輯于星期日常用的方法：將轉(zhuǎn)化后生長的菌落，復(fù)印到硝酸纖維膜上，再用堿裂細菌菌落，釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因的表達、基因定位、克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列檢測、遺傳病疾病的診斷及生物分類等方面?，F(xiàn)在是41頁\一共有166頁\編輯于星期日一、核酸分子雜交的基礎(chǔ)1.變性與退火DNA以雙鏈形式存在，在進行分子雜交時，先將雙鏈DNA分子解聚為單鏈，這一過程稱為變性。兩條單鏈通過堿基互補，聚合成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)的過程稱為退火或復(fù)性?，F(xiàn)在是42頁\一共有166頁\編輯于星期日2.同源序列不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序，即某種程度的同源性，就可形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA（Southernblot）、RNA與DNA（Northernblot）或RNA與RNA（Insitu）的二條單鏈之間進行?，F(xiàn)在是43頁\一共有166頁\編輯于星期日3.分子雜交法分子雜交是通過一定方法，將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的核酸分子雜交，經(jīng)顯影后，顯示出目的DNA或RNA所處的位置。分子雜交就是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行雜交?，F(xiàn)在是44頁\一共有166頁\編輯于星期日4.探針經(jīng)過同位素或非同位素標(biāo)記的已知序列的寡核苷酸。單一的已知序列的寡核苷酸探針，能與它們的目的序列配對，可以準(zhǔn)確地設(shè)計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效。現(xiàn)在是45頁\一共有166頁\編輯于星期日5.雜交的靈敏度和特異性核酸分子雜交具有高度的靈敏度和特異性。可以根據(jù)所使用的探針的已知序列，進行特異性的靶序列檢測?，F(xiàn)在是46頁\一共有166頁\編輯于星期日二、探針的類型根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為：DNA探針、RNA探針、cDNA探針和寡核酸探針。根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物，可分為：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。根據(jù)是否存在互補鏈，可分為：單鏈和雙鏈探針。根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為：均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。現(xiàn)在是47頁\一共有166頁\編輯于星期日1.雙鏈DNA探針雙鏈DNA探針的合成方法主要有兩種：①切口平移法。②隨機引物合成法?，F(xiàn)在是48頁\一共有166頁\編輯于星期日2.單鏈DNA探針單鏈DNA探針主要有兩種合成方法:①以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針。②以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針?，F(xiàn)在是49頁\一共有166頁\編輯于星期日3.末端標(biāo)記DNA探針以Klenow片段標(biāo)記3’末端為例說明末端標(biāo)記的方法?，F(xiàn)在是50頁\一共有166頁\編輯于星期日4.寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫?，F(xiàn)在是51頁\一共有166頁\編輯于星期日三、探針的標(biāo)記方法與選擇1.探針標(biāo)記的方法①缺口平移法②DNA快速末端標(biāo)記③T4多核苷酸激酶標(biāo)記DNA5’末端法④隨機引物延伸法⑤聚合酶鏈反應(yīng)法?，F(xiàn)在是52頁\一共有166頁\編輯于星期日2.標(biāo)記方法的選擇根據(jù)實驗的要求如靈敏度和顯示方法等，選擇合適的標(biāo)記方法。①一般放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。②在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。③在對靈敏度要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)，或比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)或過氧化物酶系統(tǒng)?，F(xiàn)在是53頁\一共有166頁\編輯于星期日四、分子雜交1.常用的核酸雜交方法①Southern印跡雜交（Southernblot）②Northern印跡雜交（Northernblot）③菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）④組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）等。⑤點雜交（Dotblot）現(xiàn)在是54頁\一共有166頁\編輯于星期日2.分子雜交的分類根據(jù)被測定的對象不同，可分為2大類:(1)Southern雜交被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。(2)Northern雜交RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜（NC）上，然后用探針雜交。被檢對象為RNA，探針為DNA或RNA。現(xiàn)在是55頁\一共有166頁\編輯于星期日五、Southernblot1.Southern雜交或DNA印跡1975年由Southern創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。用DNA或RNA探針檢測樣品DNA。2.特點Southern雜交用以檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列。從宿主細胞中提取基因組DNA或質(zhì)粒載體，再用探針雜交。只有插入目的片段的重組體，才能與探針雜交，并在X光底片上曝光顯示印跡。現(xiàn)在是56頁\一共有166頁\編輯于星期日3.雜交的方法轉(zhuǎn)膜：將DNA樣本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性、Tris緩沖液中和、高鹽下通過毛吸作用，將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）濾膜上，烘干固定后，即可用于雜交。雜交：在一定條件下，探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。通過自顯影檢查目的DNA所在位置?，F(xiàn)在是57頁\一共有166頁\編輯于星期日4.雜交的步驟或程序(1)酶切待測目的DNA，凝膠電泳分離各酶切片段，并使DNA原位變性為單鏈。(2)將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）濾膜或尼龍膜上。(3)預(yù)雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。(4)讓單鏈的探針與同源DNA片段雜交，漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。(5)通過自顯影檢測目的DNA所在位置。現(xiàn)在是58頁\一共有166頁\編輯于星期日Southern雜交(Southern印跡法)將混合在一起的限制性酶切DNA片段，用瓊脂糖電泳分開，并變性為單鏈DNA，再轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜上。在膜上的單鏈DNA可用32p標(biāo)記的單鏈DNA探針雜交。再用放射自顯影方法，顯示出與探針順序互補的限制性酶切DNA片段的位置。這個方法能將上萬個片段中的某一個特殊的目的片段鑒定出來?，F(xiàn)在是59頁\一共有166頁\編輯于星期日圖Southernblot現(xiàn)在是60頁\一共有166頁\編輯于星期日圖Southernblot現(xiàn)在是61頁\一共有166頁\編輯于星期日凝膠電泳底片顯示雜交印跡圖Southern印跡現(xiàn)在是62頁\一共有166頁\編輯于星期日六、Northernblot1.Northern印跡雜交對被檢測的RNA進行變性凝膠電泳，以除去RNA中的二級結(jié)構(gòu)，使大小不同的RNA完全分離。將變性后RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，然后與探針雜交?，F(xiàn)在是63頁\一共有166頁\編輯于星期日2.特點用DNA或RNA探針檢測RNA樣品。從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛變性RNA，變性后的RNA有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，以及保持其單鏈狀態(tài)。用NaOH會水解RNA?，F(xiàn)在是64頁\一共有166頁\編輯于星期日七、DNA-RNA雜交DNA-RNA雜交采用R-環(huán)檢測法。選擇過程①用mRNA與重組載體雜交。②在70%甲酰胺中，DNA雙鏈變性，復(fù)性時，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。③電鏡下可見到R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。現(xiàn)在是65頁\一共有166頁\編輯于星期日圖DNA-RNA雜交（R-環(huán)）現(xiàn)在是66頁\一共有166頁\編輯于星期日八、菌落原位雜交

Colonyinsituhybridization1.雜交的方法①將細菌從平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。②將濾膜上的菌落原位裂解，以釋出DNA。③烘干，將DNA固定于膜上。④與32P標(biāo)記的探針雜交。⑤平板置于4℃，放射自顯影，檢測菌落雜交信號（結(jié)果），并與平板上的菌落對應(yīng)?，F(xiàn)在是67頁\一共有166頁\編輯于星期日2.特點對應(yīng)的菌斑(或噬菌斑)位置不變，可以直接找出陽性菌落。對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(~200)進行克隆篩選時可采用本法。將分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。現(xiàn)在是68頁\一共有166頁\編輯于星期日圖菌落原位雜交Colonyinsituhybridization現(xiàn)在是69頁\一共有166頁\編輯于星期日九、組織原位雜交Tissueinsituhybridization，簡稱原位雜交1.方法組織或細胞經(jīng)適當(dāng)處理后，使細胞通透性增加，探針直接進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。現(xiàn)在是70頁\一共有166頁\編輯于星期日2.特點組織的原位雜交與菌落的原位雜交不同，可以確定探針的互補序列在細胞內(nèi)的空間位置。例如，通過與細胞RNA的雜交，可分析一種RNA在細胞組織中的分布、顯示細胞及病原微生物的存在方式和部位等。

現(xiàn)在是71頁\一共有166頁\編輯于星期日十、斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交,以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其在本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號?，F(xiàn)在是72頁\一共有166頁\編輯于星期日點雜交法（Dotblot）將被檢測標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準(zhǔn)確方便，有多種多管吸印儀如Bio-Dot(Bio–Rad)，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進行雜交?，F(xiàn)在是73頁\一共有166頁\編輯于星期日凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小?，F(xiàn)在是74頁\一共有166頁\編輯于星期日1.核酸雜交重組克隆與探針雜交。2.檢測用的探針與外源DNA插入片段互補的序列。3.識別標(biāo)記（1）放射性同位素：32P或125I。（2）非放射性標(biāo)記：熒光素一、原理現(xiàn)在是75頁\一共有166頁\編輯于星期日酶切前酶切后插入片段載體載體載體重組體重組體現(xiàn)在是76頁\一共有166頁\編輯于星期日第五節(jié)免疫化學(xué)檢測法對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白—蛋白“雜交”利用抗體作為“探針”，檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。現(xiàn)在是77頁\一共有166頁\編輯于星期日一、放射性抗體檢測法1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：現(xiàn)在是78頁\一共有166頁\編輯于星期日待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗現(xiàn)在是79頁\一共有166頁\編輯于星期日2.放射性抗體檢測法過程現(xiàn)在是80頁\一共有166頁\編輯于星期日3.Broome-Gilbert雙位點檢測法檢測融合蛋白既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物現(xiàn)在是81頁\一共有166頁\編輯于星期日質(zhì)粒基因A插入基因B表達質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白現(xiàn)在是82頁\一共有166頁\編輯于星期日固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光現(xiàn)在是83頁\一共有166頁\編輯于星期日二、免疫沉淀檢測法1.原理利用抗原—抗體凝集反應(yīng)。用于檢測分泌型產(chǎn)物。現(xiàn)在是84頁\一共有166頁\編輯于星期日2.方法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）?，F(xiàn)在是85頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是86頁\一共有166頁\編輯于星期日三、酶聯(lián)免疫吸附測（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理一抗（primaryantibody）與目標(biāo)分子的特異結(jié)合二抗（secondaryantibody）與一抗的特異性結(jié)合酶連（enzyme-linke）二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量?，F(xiàn)在是87頁\一共有166頁\編輯于星期日待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

現(xiàn)在是88頁\一共有166頁\編輯于星期日2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?，F(xiàn)在是89頁\一共有166頁\編輯于星期日孔底現(xiàn)在是90頁\一共有166頁\編輯于星期日（2）一抗結(jié)合加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體現(xiàn)在是91頁\一共有166頁\編輯于星期日一抗現(xiàn)在是92頁\一共有166頁\編輯于星期日（3）二抗結(jié)合加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。現(xiàn)在是93頁\一共有166頁\編輯于星期日二抗現(xiàn)在是94頁\一共有166頁\編輯于星期日（4）顯色反應(yīng)加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）?，F(xiàn)在是95頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是96頁\一共有166頁\編輯于星期日圖ELISAassay現(xiàn)在是97頁\一共有166頁\編輯于星期日（5）比色在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果?，F(xiàn)在是98頁\一共有166頁\編輯于星期日圖Safire多功能掃描型酶標(biāo)儀現(xiàn)在是99頁\一共有166頁\編輯于星期日3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）現(xiàn)在是100頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是101頁\一共有166頁\編輯于星期日臨床檢驗常用的單抗現(xiàn)在是102頁\一共有166頁\編輯于星期日四、免疫印跡法（westernblotting）在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶現(xiàn)在是103頁\一共有166頁\編輯于星期日1.原理（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）①SDS是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負電荷②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開?，F(xiàn)在是104頁\一共有166頁\編輯于星期日電泳buffer電泳buffer圖電泳槽現(xiàn)在是105頁\一共有166頁\編輯于星期日點樣電泳方向圖現(xiàn)在是106頁\一共有166頁\編輯于星期日③蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。商品化供應(yīng)道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓現(xiàn)在是107頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是108頁\一共有166頁\編輯于星期日Dalton現(xiàn)在是109頁\一共有166頁\編輯于星期日④凝膠中的蛋白質(zhì)染色：1）直接染色考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進行染色?，F(xiàn)在是110頁\一共有166頁\編輯于星期日圖直接染色電泳結(jié)果現(xiàn)在是111頁\一共有166頁\編輯于星期日（2）Westernblotting①Western（轉(zhuǎn)膜）電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）現(xiàn)在是112頁\一共有166頁\編輯于星期日膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上現(xiàn)在是113頁\一共有166頁\編輯于星期日膜膠蛋白現(xiàn)在是114頁\一共有166頁\編輯于星期日圖Western裝置現(xiàn)在是115頁\一共有166頁\編輯于星期日②Blotting原理與ELISA相同。辣根過氧化物酶：HRPO現(xiàn)在是116頁\一共有166頁\編輯于星期日待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光現(xiàn)在是117頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是118頁\一共有166頁\編輯于星期日③Blotting過程1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。ImmunoBlotting現(xiàn)在是119頁\一共有166頁\編輯于星期日④結(jié)果現(xiàn)在是120頁\一共有166頁\編輯于星期日圖單抗blotting結(jié)果現(xiàn)在是121頁\一共有166頁\編輯于星期日圖多克隆抗體Blotting的結(jié)果現(xiàn)在是122頁\一共有166頁\編輯于星期日第六節(jié)翻譯篩選法借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因?，F(xiàn)在是123頁\一共有166頁\編輯于星期日一、無細胞翻譯系統(tǒng)能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細胞提取物系統(tǒng)?，F(xiàn)在是124頁\一共有166頁\編輯于星期日二、轉(zhuǎn)譯篩選與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？現(xiàn)在是125頁\一共有166頁\編輯于星期日mRNA無細胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在是126頁\一共有166頁\編輯于星期日三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法1.原理mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）?，F(xiàn)在是127頁\一共有166頁\編輯于星期日單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯現(xiàn)在是128頁\一共有166頁\編輯于星期日2.過程現(xiàn)在是129頁\一共有166頁\編輯于星期日四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1.原理在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）?，F(xiàn)在是130頁\一共有166頁\編輯于星期日2.過程現(xiàn)在是131頁\一共有166頁\編輯于星期日硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸現(xiàn)在是132頁\一共有166頁\編輯于星期日五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。現(xiàn)在是133頁\一共有166頁\編輯于星期日待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記現(xiàn)在是134頁\一共有166頁\編輯于星期日第七節(jié)真核重組基因的選擇方法一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。現(xiàn)在是135頁\一共有166頁\編輯于星期日二氫葉酸還原酶

dihydrofolatereductase，DHFR二氫葉酸四氫葉酸DHFR現(xiàn)在是136頁\一共有166頁\編輯于星期日②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：現(xiàn)在是137頁\一共有166頁\編輯于星期日dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

現(xiàn)在是138頁\一共有166頁\編輯于星期日③次黃嘌呤的補救作用細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。④胸苷酸激酶的補救作用TK+細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活?，F(xiàn)在是139頁\一共有166頁\編輯于星期日TtkdUMP

dATP

TTP

dCTP

次黃嘌呤

補救

氨甲喋啉

抑制

抑制

現(xiàn)在是140頁\一共有166頁\編輯于星期日（2）TK選擇過程①HAT培養(yǎng)基含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）②宿主細胞Tk-細胞株③載體標(biāo)記TK基因，只有轉(zhuǎn)入TK基因的細胞才能生存?，F(xiàn)在是141頁\一共有166頁\編輯于星期日現(xiàn)在是142頁\一共有166頁\編輯于星期日2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基?，F(xiàn)在是143頁\一共有166頁\編輯于星期日dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸現(xiàn)在是144頁\一共有166頁\編輯于星期日二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶現(xiàn)在是145頁\一共有166頁\編輯于星期日DHFR+細胞DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補救！現(xiàn)在是146頁\一共有166頁\編輯于星期日DHFR-細胞DHFR-細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。需要補救！現(xiàn)在是147頁\一共有166頁\編輯于星期日②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:現(xiàn)在是148頁\一共有166頁\編輯于星期日dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救現(xiàn)在是149頁\一共有166頁\編輯于星期日（2）選擇過程①宿主細胞DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救?、跓o核苷酸的培養(yǎng)基透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救?，F(xiàn)在是150頁\一共有166頁\編輯于星期日③氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補救作用，可提高選擇。DHFR+基因。