免疫共沉淀研究生實驗課專家講座

背景據(jù)預計，人體中大約總共可產(chǎn)生500,000種蛋白，而單個細胞能夠產(chǎn)生10,000種。在這些蛋白中，80%不是以獨立方式存在，而是存在于一個蛋白復合體中。蛋白-蛋白相互作用包含在一個細胞網(wǎng)絡(luò)中，我們形象地稱之為經(jīng)過節(jié)點（nodes）連接樞紐（hubs）。蛋白相互作用免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第1頁StandardTechniques Glutathione-S-TransferaseFusionProteins AffinityTags TandemAffinityPurification(TAP)Tags Strep-TagIII QuantitativeProteomics ChemicalCrosslinking Two-hybridYeast Phage-display

UniversalVerificationofInteractionTechniques Co-Immunoprecipitation ConfocalMicroscopy

BiophysicalVerificationofInteractionTechniques FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET) GFP-ProteinProximityImagingMicroscopy(GFP-PRIM) MassSpectroscopy(MS) AtomicForceMicroscopy(AFM) SurfacePlasmonResonance(SPR)免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第2頁試驗?zāi)繕藢W習并掌握免疫共沉淀原理及操作方法，了解免疫共沉淀結(jié)果分析。了解與免疫共沉淀相關(guān)試驗及進展免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第3頁免疫共沉淀是以抗體和抗原之間專一性作用為基礎(chǔ)用于研究蛋白質(zhì)相互作用經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用有效方法。金標準

用途：測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一個特定蛋白質(zhì)新作用搭檔。概念及用途免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第4頁bindingwashelutionYYYYY當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間相互作用被保留了下來。假如用蛋白質(zhì)x抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。試驗原理免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第5頁免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第6頁人腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于直徑為6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)大約90%以上融合后，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗3次；加入1mlLysisBuffer（20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,Cocktailproteinase，pH7.5），冰上放置30min，裂解細胞；試驗步驟免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第7頁采取溫和裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在全部蛋白質(zhì)相互作用，多采取非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細胞裂解條件不一樣，經(jīng)過經(jīng)驗確定。不能用高濃度變性劑（0.2％SDS)。為預防蛋白分解，修飾，溶解抗原緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行試驗。

Na3VO4作用為保護磷酸化蛋白不會被磷酸酶還原。所以在做磷酸化信號轉(zhuǎn)導時需添加。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第8頁將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃轉(zhuǎn)鼓搖15min，14000g4℃離心15min；吸收上清液到新EP管中，每管加1μg對照兔IgG，同時加入ProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)30min，4℃10000g離心5min；

preclear及其作用

一抗和對應(yīng)起源normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG中有相同或相同成份(如無關(guān)IgG),用一抗對應(yīng)起源IgG與蛋白裂解液和proteinA－agarose能夠去除一抗中無關(guān)IgG對蛋白裂解液中物質(zhì)非特異吸附,二是能夠去除蛋白液中與proteinA－agarose非特異結(jié)合物質(zhì)。做preclearIgG是不針對特異性抗原。瓊脂糖珠選擇

SEPHAROSE是注冊商品名,本身是agarose做凝膠。

免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第9頁轉(zhuǎn)移上清液至一新管中，將每管總蛋白定量至500-(250-1000)μg，用lysisBuffer將體積補齊至600-800μl。加入AKT兔抗人多克隆抗體10μl，4℃轉(zhuǎn)鼓過夜(10min)；孵育液體積控制：考慮抗體/緩沖液百分比。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘余在上清。緩沖液太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。加入35μlProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)2h(10min)

；1000g4℃離心5min，PBS洗3次，加入40μl2×SDSSampleBuffer（125mMTris?ClpH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mMDTT,0.02%溴酚藍）沸水浴中煮沸5min；WesternBlot檢測樣品，剩下樣品-20℃保留。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第10頁抗體選擇：1.使用明確抗體：試驗最需要注意就是抗體性質(zhì)。抗體不一樣和抗原結(jié)合能力也不一樣，免疫細胞化學染色能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。仔細檢驗抗體說明書。尤其是多抗特異性是問題，確保共沉淀蛋白是由所加入抗體沉淀得到，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體使用有利于防止污染發(fā)生；2.使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG3.抗體用量控制：1-4μg（通慣用2μg）4.確定蛋白間相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是因為細胞溶解才發(fā)生，這需要進行蛋白質(zhì)定位來確定。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第11頁優(yōu)點相互作用蛋白都是經(jīng)翻譯后修飾，處于天然狀態(tài)；蛋白相互作用是在自然狀態(tài)下進行，能夠防止人為影響；能夠分離得到天然狀態(tài)相互作用蛋白復合物。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第12頁缺點可能檢測不到低親和力和瞬間蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用兩種蛋白質(zhì)結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；如用westernblot檢驗，必須在試驗前預測目標蛋白是什么，以選擇最終檢測抗體，若預測不正確，試驗就得不到結(jié)果（但假如結(jié)合質(zhì)譜檢測就能夠分析全部結(jié)合蛋白種類）。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第13頁經(jīng)過質(zhì)譜確定捕捉蛋白免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第14頁結(jié)果分析鹽離子濃度影響coIP結(jié)果

很多蛋白復合體對鹽濃度敏感，但敏感性有強弱之別。通常來說，真實存在著蛋白復合體能耐受生理鹽（0.15M）或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會解體。詳細如，某種CDK和Cyclin其牢靠程度能耐受0.8-1.0M以上高鹽而不解體。所以，了解一個蛋白復合體對鹽濃度耐受，既是一個幫助判斷蛋白復合體是否真實存在一個主要依據(jù)，更是一個非常主要生化數(shù)據(jù)；對一些體外生化反應(yīng)蛋白原料純化制備也是很主要輔助依據(jù)。在生理鹽或更低鹽濃度下進行coIP可能增加假陽性幾率—很多蛋白間非特異性黏粘被統(tǒng)計下來。通常選擇0.15-0.3M做細胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進行IP。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第15頁2.過表示

血清中豐富BSA能夠被任意抗體識別（其實也是一個相互作用），同理高豐度兩種或各種蛋白人為拼湊到一起，也能夠非特異性黏粘或者發(fā)生弱相互作用。3.不添加NP40一類表面活性劑，減弱對非特異性結(jié)合拮抗

NP40除能夠在膜上穿孔外，也能夠有效拮抗非特異性蛋白相互作用，提升coIP特異性。通常IP體系中NP40含量0.2-0.5%。NP40在0.5-1.0%時，染色體很輕易析出，造成樣品過粘而需要超聲。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第16頁4.超聲和凍融影響很多市售或自制裂解液過于溫和，需要考慮采取機械或者超聲等伎倆提升裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱相互作用）。不過，有些時候裂解液凍融又可能影響一些弱相互作用，所以不太提議凍融裂解液——即最好裂解液制備好后馬上進行coIP。假如證實凍融無影響可考慮將蛋白樣品保留-80度待用。5.Tag影響

His-tagged主要用于純化蛋白。用His-tagged蛋白進行coIP存在潛在隱患。因為很多蛋白會有富含histidinedomain，碰到效價非常好抗體會使很多內(nèi)源性蛋白都被該抗體識別。造成coIP假象。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第17頁

TAPtag不能用于分析鈣調(diào)信號通路。TAPtag實際上從成本角度和Histag差不多，洗脫試劑價格低廉，所以可用于質(zhì)譜分析，能獲取最全方面相互作用信息。然而因為其中包含鈣調(diào)蛋白和蛋白A相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間相互作用，有一定應(yīng)用局限。

Myc、HA、Flag-tagged：Myc依然會有天然干擾，應(yīng)用略有局限；相較后二者是人工合成專門用于tagged蛋白（有對應(yīng)專利，所以當前不論抗體或交聯(lián)好beads價格都非常昂貴），所以干擾最小、最慣用。如需深入細致區(qū)分，a-Flag效價比a-HA略高，所以更適合IP。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第18頁tag位置。將tag構(gòu)建到蛋白N端還是C端，也是一個潛在能夠影響coIP結(jié)果原因。比如，分泌蛋白N端通常有分泌信號肽，假如將tag構(gòu)建到N端，則外分泌時會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白C端是疏水區(qū)，有時候?qū)ag構(gòu)建在C端會影響蛋白原來空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時是相互作用結(jié)構(gòu)域，一些時候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。所以，通常構(gòu)建質(zhì)粒時候是N端、C端tagged同時分別構(gòu)建，以備萬一。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第19頁更高效方法使用Dynabeads?蛋白A或G進行免疫沉淀反應(yīng)

Dynabeads

磁珠vs瓊脂糖珠分離純化蛋白質(zhì)重視品質(zhì)和特異性，而非數(shù)量。此時，磁珠是最正確選擇。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第20頁常見問題及處理策略目標蛋白分子量比預期大？最少兩種可能性是存在

一個是在所謂“搖”過程中，目標蛋白被修飾。正常細胞中有很多departments，每個department都有特定蛋白存在，比如線粒體蛋白、溶酶體蛋白、葉綠體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白、核蛋白；一旦細胞被勻漿化，各個departments就不存在了，每個蛋白都會與其它全部蛋白有接觸機會，所以，發(fā)生一些unexpected修飾（或切割）是正?，F(xiàn)象。

再有一個可能是B蛋白只能結(jié)合被修飾A蛋白，從而在免疫沉淀過程中富集了這種被修飾A蛋白。免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第21頁2.

背景深條帶多，特異性差。最簡單改進方法：換特異性高抗體，最好用單抗。假如不換抗體，還能夠改進共沉淀條件，比如孵育溫度，孵育時間，抗體濃度等等。另外，曝光時候，時間不要太長，能夠降低背景。也可能是抗體濃度過高，能夠降低抗體作用濃度。3.沒有檢測到與目標蛋白相互作用蛋白或者檢測得到信號太弱

裂解液中去垢劑濃度過高或者配方過于猛烈：降低去垢劑濃度或者更換去垢劑種類（按作用猛烈程度來區(qū)分:SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS）

受蛋白亞細胞定位影響：重新選擇裂解液配方以釋放目標蛋白

蛋白之間相互作用太弱或者不太穩(wěn)定：選擇親和力更高抗體以捕捉更多目標蛋白從而捕捉更多相互作用蛋白;過表示提升目標蛋白含量；選擇目標蛋白或者相互作用蛋白含量高樣品進行免疫共沉淀試驗免疫共沉淀研究生實驗課專家講座第22頁相關(guān)技術(shù)體外免疫共沉淀（TnT試劑盒，promega）免疫沉淀（immunoprecipitation）

利用抗體可與