內(nèi)毒素的測(cè)定課件

內(nèi)毒素和1，3-β-D-葡聚糖檢測(cè)的臨床應(yīng)用主要內(nèi)容內(nèi)毒素的來(lái)源及結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素的生物學(xué)活性內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床應(yīng)用內(nèi)毒素的檢測(cè)方法及參考范圍檢測(cè)樣本的采集及影響因素內(nèi)毒素概述內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖（LPS），這些成分只在細(xì)菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。外層菌體多糖（O抗原），與細(xì)菌侵襲力有關(guān)。中層同一種屬之間是相同的。內(nèi)層特殊的糖磷脂，起毒性作用，而無(wú)種屬特異性。特異性多糖核心多糖類脂A內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)熱反應(yīng)1激活血管活性物質(zhì)的釋放2激活凝血和纖溶系統(tǒng)3內(nèi)毒素的生物學(xué)活性直接或間接損害肝臟5激活白三烯、前列腺素及單核巨噬系統(tǒng)6內(nèi)毒素的生物學(xué)活性激活補(bǔ)體4內(nèi)毒素的有益作用增加機(jī)體非特異性免疫力1防御放射性損傷，促進(jìn)粒細(xì)胞生成2增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能3抗腫瘤，免疫佐劑作用4內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥外源性內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因腸道內(nèi)毒素的吸收1敗血癥時(shí)血中細(xì)菌的釋放23有效的抗菌治療后，細(xì)菌崩解輸入了含有細(xì)菌的藥物、血液或者體液等。內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對(duì)內(nèi)毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細(xì)胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。

內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀最嚴(yán)重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床應(yīng)用在肝膽疾病中的應(yīng)用1在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用2在胰腺疾病中的應(yīng)用3在潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用4在全身性細(xì)菌感染中的應(yīng)用5在不明原因發(fā)熱中的應(yīng)用6內(nèi)毒素檢測(cè)在醫(yī)院中的應(yīng)用在醫(yī)院滅菌制劑檢驗(yàn)中應(yīng)用1對(duì)注射器、輸液器等醫(yī)療器械的內(nèi)毒素檢測(cè)2在透析站和血站中的應(yīng)用3在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用4鱟試驗(yàn)是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細(xì)胞與微量?jī)?nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷試品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的一種方法。內(nèi)毒素的檢測(cè)方法內(nèi)毒素的檢測(cè)原理革蘭陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）檢測(cè)原理：革蘭陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）激活酶反應(yīng)主劑中的相應(yīng)因子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）濃度進(jìn)行定量測(cè)定。內(nèi)毒素的檢測(cè)原理GG內(nèi)毒素的檢測(cè)方法鱟試劑（LimulusamebocytelysateLAL)

凝膠法——0.03EU/ml范圍內(nèi)半定量1濁度法——0.006-300EU/ml,檢測(cè)范圍大2比色法——0.006-15EU/ml范圍內(nèi)定量3ELISA——0.1pg/ml4流式細(xì)胞術(shù)——測(cè)內(nèi)毒素的量而不是活性5化學(xué)發(fā)光測(cè)定法6檢測(cè)樣本的采集及影響因素檢測(cè)樣本：血液采集要求：采樣過程要求無(wú)菌操作，用專用的無(wú)熱原真空采血管。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應(yīng)在3000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心，若不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無(wú)熱原轉(zhuǎn)移管內(nèi)，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。特殊標(biāo)本處理：對(duì)一般黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，稀釋2~5倍后進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于嚴(yán)重的黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，應(yīng)重新采血。

影響結(jié)果的因素產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因有：操作環(huán)境及操作過程中污染，應(yīng)用某些抗生素類如-酰胺內(nèi)酯類、喹喏酮類等患者。(1-3)--D-葡聚糖侵襲性真菌感染的定義定義:

指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。條件致病性真菌念珠菌屬曲霉屬其他1.內(nèi)源性誘因2.外源性誘因影響機(jī)體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結(jié)核、肺膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑；插管等侵襲性治療，骨髓和實(shí)體器官移植；免疫缺陷綜合癥侵襲性真菌感染的誘因國(guó)內(nèi)侵襲性真菌感染不容忽視

劉正印等，中華醫(yī)學(xué)雜志2003,83(5):399-402感染人數(shù)國(guó)內(nèi)侵襲性真菌感染不容忽視

臨床藥物治療雜志2007年第5卷第1期感染率(%)中國(guó)感染與化療雜志2008年7月20日第8卷第4期

尸檢研究發(fā)現(xiàn)，75%的侵襲性真菌感染病例在生前漏診

診斷困難的主要原因：

---臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋

---確診常需侵入性手段獲得組織標(biāo)本，侵入性操作常因患者的病情所限難以實(shí)施---真菌檢測(cè)項(xiàng)目開展相對(duì)不足或滯后IFI診斷困難及漏診情況嚴(yán)重主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病肺炎肺纖維癥腦出血腦梗塞硬膜下血瘤術(shù)后胸部大動(dòng)脈瘤術(shù)后糖尿病再生障礙性貧血MODSDIC胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤肺結(jié)核腹腔內(nèi)膿腫AIDS呼吸系統(tǒng)疾病感染及寄生蟲病循環(huán)系統(tǒng)疾病內(nèi)分泌疾病血液及造血器官疾病腫瘤類侵襲性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)的發(fā)病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungalinfection,IPFI)最常見,大約占50%～60%。未經(jīng)及時(shí)治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達(dá)30%～80%

。

侵襲性肺部真菌感染臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咯血、胸悶、呼吸困難等。

現(xiàn)狀：兩高兩低一快檢測(cè)方法相對(duì)滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的新型抗真菌藥物價(jià)格昂貴,導(dǎo)致病死率高。高院內(nèi)感染率和病死率低臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷率患者病情惡化快

侵襲性肺部真菌感染死亡率(%)診斷延遲時(shí)間(h)ICU診斷延遲時(shí)間與死亡率的關(guān)系1133303510152025303512h12-24h

24-48h48hMorrellMetal.AntimicrobAgentsChemother2005,49:3640–3645.美國(guó)四大醫(yī)療中心做的一項(xiàng)回顧性研究死亡率(%)診斷延遲時(shí)間(d)GareyKWetal.ClinInfectDis2006,43:25–31.b1,6葡聚糖

磷脂雙分子層幾丁質(zhì)麥角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteinsβ1,3真菌細(xì)胞膜、壁結(jié)構(gòu)羊毛固醇C－14去甲基化酶14位還原和7－8位異構(gòu)酶角鯊烯環(huán)氧化酶1-3-β-D-葡聚糖本質(zhì)及特點(diǎn)真菌細(xì)胞壁成分，占50%以上1其他微生物、動(dòng)物及人的細(xì)胞不含該成分2用于侵襲性真菌感染的早期診斷3(1-3)-β-D-葡聚糖特性1.2.3.對(duì)熱極為穩(wěn)定，高壓121℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含量較多，對(duì)G試驗(yàn)靈敏。當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來(lái)，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可將其清除。在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來(lái)，故其在體液中的量不增高。“G”試驗(yàn)緣何而來(lái)？1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗(yàn)。（1-3）-D-GlucanLAL-RM(反應(yīng)物)G因子活化G因子凝固酶原 凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝膠）試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理圖：內(nèi)毒素與β-葡聚糖的檢測(cè)比較已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和β-葡聚糖，但它們的反應(yīng)曲線不一樣。內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點(diǎn)的斜線。

內(nèi)毒素和β-葡聚糖與鱟試劑反應(yīng)的特征曲線觀察期不確定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，特征性不明顯并對(duì)醫(yī)師的專業(yè)水平要求高輔助方法：臨床表現(xiàn)，免疫學(xué)，病理學(xué)，影像學(xué)檢查等用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，已成為這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)3.PCR技術(shù)：真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)檢查和真菌核酸檢測(cè)對(duì)兒童及接受造血干細(xì)胞移植患者、ICU患者不適用2.GM試驗(yàn)：曲霉屬半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)。判斷是否曲霉屬真菌感染耗時(shí)短，靈敏度高，特異性強(qiáng)，定量檢測(cè)可判斷感染嚴(yán)重程度1.G試驗(yàn)：通過檢測(cè)(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染非傳統(tǒng)檢查敏感性低，耗時(shí)長(zhǎng),培養(yǎng)陽(yáng)性率低。培養(yǎng)結(jié)果是定性的，有些標(biāo)本采集困難直接培養(yǎng)真菌法傳統(tǒng)檢查特點(diǎn)方法侵襲性真菌感染的臨床檢測(cè)方法對(duì)比科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色：

熱帶念珠菌----灰藍(lán)色白色念珠菌----綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色其他念珠菌----白色科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色：A/E--白色假絲酵母菌，B/C-克柔假絲酵母菌，F(xiàn)--光滑假絲酵母菌，D-熱帶假絲酵母菌-D-葡聚糖的評(píng)價(jià)可檢測(cè)多種致病真菌感染念珠菌，曲霉，肺孢子菌，鐮刀菌，地霉，組織胞漿菌，毛孢子菌等不能檢測(cè)隱球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁頭霉等）敏感性、特異性：90％左右對(duì)于念珠菌血癥,G試驗(yàn)檢測(cè)是首選檢查

J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013.

BG值在IFI臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值

Pazos等報(bào)道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部HRCT檢查發(fā)現(xiàn)以前。平均早于發(fā)熱5d

早于呼吸道癥狀平均10.7d

JClin

Microbiol，2005，43(1)：299—305G試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià)

Odabasi等對(duì)確診為粒細(xì)胞缺乏人群進(jìn)行為期3周每周2次采血檢測(cè)及臨床觀察發(fā)現(xiàn)：BG值開始高于60pg／ml的時(shí)間比最后確診為IFI或臨床診斷IFI平均提前了10d

ClinInfectDis，2004，39(2)：199—205G試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià)-D-葡聚糖參考值檢測(cè)值﹤10pg/ml,陰性。檢測(cè)值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動(dòng)態(tài)采血檢測(cè)。檢測(cè)值﹥20pg/ml，陽(yáng)性(深部真菌感染)，建議再次采血以確診。關(guān)于G試驗(yàn)建議G試驗(yàn)臨床應(yīng)用

1明確診斷（抗真菌藥物治療前）

2治療效果監(jiān)測(cè)（抗真菌藥物治療后）

3連續(xù)2次采血進(jìn)行G試驗(yàn)標(biāo)本采集及保存臨床細(xì)菌內(nèi)毒素及

(1-3)--D-Glucan檢測(cè)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展國(guó)外：血液（包括血