中藥藥物分析方法

中藥藥物分析方法中藥藥物分析方法第1頁

控制中藥質(zhì)量，對確保中醫(yī)臨床用藥安全、合理、有效、可靠極為主要。而中藥中有效成份含量多少與其質(zhì)量優(yōu)劣有直接關(guān)系，另首先，含有毒劇成份中藥，只有嚴(yán)格控制其毒劇成份含量，才能確保臨床用藥安全和有效。所以，中藥成份定量分析是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究關(guān)鍵個(gè)別，亦是質(zhì)量控制中最能有效考查中藥材內(nèi)在質(zhì)量項(xiàng)目，同時(shí)也是中藥穩(wěn)定性考查依據(jù)。中藥藥物分析方法第2頁方法學(xué)考查提取條件考查測定方法與條件選擇定量分析方法驗(yàn)證第一節(jié)中藥藥品分析方法學(xué)驗(yàn)證中藥藥物分析方法第3頁

定量分析方法驗(yàn)證

內(nèi)容包含準(zhǔn)確度、精密度線性與范圍專屬性、檢測限、定量限耐用性中藥藥物分析方法第4頁第二節(jié)化學(xué)分析法

重量分析法：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法酸堿滴定法滴定分析法

沉淀滴定法配位滴定法氧化還原滴定法

中藥藥物分析方法第5頁重量分析法中藥藥物分析方法第6頁標(biāo)準(zhǔn)溶液化學(xué)計(jì)量關(guān)系指示劑被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液待測溶液

滴定分析法中藥藥物分析方法第7頁

第三節(jié)紫外-可見分光光度法應(yīng)用

中藥藥物分析方法第8頁一、原理Lambert-Beer定律：當(dāng)入射光波長一定時(shí)，待測溶液吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為百分比系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長相關(guān)。

當(dāng)濃度以g/L表示時(shí)，稱k為吸光系數(shù)，以a表示，即

當(dāng)濃度以mol/L表示時(shí)，稱k為摩爾吸光系數(shù)，以表示，即比a更常見。越大，表示方法靈敏度越高。與波長相關(guān)，所以，常以表示。中藥藥物分析方法第9頁二、定量分析

1.單組份定量分析法應(yīng)用（1）吸收系數(shù)法

依據(jù)Beer定律A=εcl，若l和吸光系數(shù)ε或已知，即可依據(jù)測得A求出被測物濃度。中藥藥物分析方法第10頁（2）工作曲線法

從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度-濃度曲線求得樣品溶液濃度。

中藥藥物分析方法第11頁（3）對照品對照法

C樣=C標(biāo)A樣/A標(biāo)；

C標(biāo)A樣/（A標(biāo)C樣）=樣品%

C樣和C標(biāo)分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度

C樣為樣品標(biāo)示濃度。中藥藥物分析方法第12頁（四）示例

例：B12樣品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm洗手池，在361nm處測得吸光度A為0.507，則：中藥藥物分析方法第13頁2.解方程組法

因?yàn)槲舛群屑雍闲?，所以能夠在同一試樣中測定多個(gè)組份。設(shè)試樣中有兩組份X和Y，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會(huì)出現(xiàn)如圖所表示三種情況：

圖a)：X,Y組份最大吸收波長不重迭，相互不干擾，能夠按兩個(gè)單一組份處理。圖b)和c)：X,Y相互干擾，此時(shí)可經(jīng)過解聯(lián)立方程組求得X和Y濃度：其中，X,Y組份在波長1和2處摩爾吸光系數(shù)可由已知濃度X,Y純?nèi)芤簻y得。解上述方程組可求得cx及cy。

中藥藥物分析方法第14頁3.雙波長法

當(dāng)混合物吸收曲線重迭時(shí)，如右下列圖所表示，可利用雙波長法來測定。詳細(xì)做法：將a視為干擾組份，現(xiàn)要測定b

組份。a)

分別繪制各自吸收曲線；b)

畫一平行于橫軸直線分別交于a組份曲線上兩點(diǎn)，并與b組分相交；c)

以交于a上一點(diǎn)所對應(yīng)波長1

為參比波長，另一點(diǎn)對應(yīng)為測量波長2，并對混合液進(jìn)行測量，得到：

A1=A1a+A1b+A1sA2=A2a+A2b+A2s若兩波優(yōu)點(diǎn)背景吸收相同，即A1s=A2s二式相減，得，A=(A2a-A1a)+(A2b-A1b)因?yàn)閍組份在兩波優(yōu)點(diǎn)吸光度相等，所以，A=(A2b-A1b)=(2b-1b)lcb從中可求出cb同理，可求出ca.中藥藥物分析方法第15頁4.導(dǎo)數(shù)光譜法（1）導(dǎo)數(shù)光譜特點(diǎn)零階光譜λmax處，對應(yīng)于奇階導(dǎo)數(shù)光譜（n=1、3、5……）零點(diǎn)和偶階導(dǎo)數(shù)（n=2、4……）極值點(diǎn)（峰或谷），零階導(dǎo)數(shù)拐點(diǎn)波長，對應(yīng)于奇階導(dǎo)數(shù)光譜極值點(diǎn)和偶階導(dǎo)數(shù)光譜零點(diǎn)。導(dǎo)數(shù)光譜極值數(shù)=n+1個(gè)，即伴隨導(dǎo)數(shù)階次增加，極值數(shù)增加，譜帶變窄，變銳，分辨率提升，使重合譜帶被分離，譜帶精細(xì)結(jié)構(gòu)更顯著、更突出，有利于物質(zhì)判別。中藥藥物分析方法第16頁（1）導(dǎo)數(shù)光譜及其特征4、導(dǎo)數(shù)光譜法

通常吸收光譜，其吸收度是波長函數(shù)A=C·E=C·?（λ）。對波長求導(dǎo)，將其微分?jǐn)?shù)（dnA/dλn～λ）對波長掃描可得導(dǎo)數(shù)光譜圖。特征：

A.導(dǎo)數(shù)光譜階數(shù)愈高，峰形愈尖銳且數(shù)量亦增多。

B.在零階光譜極大處，其對應(yīng)奇階光譜經(jīng)過零點(diǎn)。在零階光譜兩拐點(diǎn)處，奇階導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。

C.偶階導(dǎo)數(shù)光譜形狀與零階光譜類似，零階光譜峰值對應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)光譜值，零階光譜拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中經(jīng)過零點(diǎn)。

D.導(dǎo)數(shù)光譜譜帶極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加1。

高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線

中藥藥物分析方法第17頁（2）定量依據(jù)

若某吸收服從Lambert-beer定律，A=ECL則依據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜定義有：

（n=1、2、3……）式中L為光積長度，對于給定物質(zhì)在一定波優(yōu)點(diǎn)為定值，令導(dǎo)數(shù)值為D，則

由此可見，在一定波優(yōu)點(diǎn)，導(dǎo)數(shù)值D與被測組分濃度C成線性關(guān)系，這是該法定量依據(jù)。中藥藥物分析方法第18頁（三）被測組分定量信息①零階光譜繪制。在同一坐標(biāo)中繪制被測組分l，常見被測組分對照品溶液和干擾組分吸收曲線，得零階光譜曲線。②微分階數(shù)（n）n越大，分辨越高，但信噪比降低，通常不超出4階，普通由干擾組分吸收曲線形狀而定。③導(dǎo)數(shù)光譜繪制選擇適當(dāng)波長間隔(△λ)繪制，為好?！鳓擞?，△A亦增大，測定靈敏度增大，但分解降低，通常選樣1～2nm。④測定方法常見工作曲線法，可依據(jù)實(shí)際情況選擇DhDp或Do作為信號參數(shù)。中藥藥物分析方法第19頁（4）應(yīng)用與示例清宮沖劑中膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜測定法

（i）干擾情況考查

膽酸對照液與樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在397nm，386nm波優(yōu)點(diǎn)有對應(yīng)吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見下左圖。豬去氧膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜將360～420nm區(qū)間吸收消除為二次無關(guān)吸收，不干擾樣品中膽酸含量測定以下中圖。下右圖表明，膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰-谷振幅值D與濃度含有良好線性關(guān)系，所以，可用397nm，386nm兩波長振幅D為定量參數(shù)，用峰-谷法進(jìn)行測定。中藥藥物分析方法第20頁

樣品，膽酸對照品溶膽酸、豬去氧膽酸二對照品溶液液二階導(dǎo)數(shù)光譜階導(dǎo)數(shù)光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜A．樣品1．膽酸B.膽酸對照品C.陰性樣品2．豬去氧膽酸中藥藥物分析方法第21頁(ⅱ)測定條件：零階光譜掃描波長：190～550nm；二階導(dǎo)數(shù)光譜掃描波長，360～420nm；Δλ=5nm。(ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱定膽酸對照品約30mg，置100ml量瓶中，加入60％醋酸稀釋至刻度，分別精密吸收0.1、0.2…1.0ml于15ml具塞刻度試管中，加60％醋酸至1.0ml，加入稀硫酸14．0ml，搖勻，70℃水浴中放置20分鐘，取出靜置20分鐘后，用1.0ml60％醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，測二階導(dǎo)數(shù)光譜。中間波長397nm，386nm，測出各峰-谷振幅值D，得回歸方程：

D=57.3066C–0.1547(r=1.000)中藥藥物分析方法第22頁(ⅳ)樣品測定精密稱取約2.5g樣品粉末加50ml氯仿回流提取4小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用60％醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸收1.0ml樣品液于15ml具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測峰-谷振幅值D，按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。本法平均回收率：102.9％，RSD＝0.6％。中藥藥物分析方法第23頁5、差示光譜法（1）基礎(chǔ)原理差示光譜法關(guān)鍵有二，其一，提供一個(gè)近似理想?yún)⒈热芤?。其二，使待測組分發(fā)生特征光譜改變，而賦形劑或其它共有組分卻不引發(fā)光譜改變，因而可消除它們干擾。設(shè)Ax、Ay分別代表兩種不一樣介質(zhì)中待測組分在測定波優(yōu)點(diǎn)吸收度，Az代表背景和干擾組分吸收度，其不受測定介質(zhì)改變影響。依據(jù)吸收度加和性原理，則

ΔA=A樣-A參=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay=(εx-εy)CL差示光譜中振幅，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)行定量測定，這可提升本法專屬性。中藥藥物分析方法第24頁（2）應(yīng)用與示例

差示光譜法測定含牛黃中成藥中膽紅素含量1）測定原理

膽紅素含有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長453nm處為最大吸收，在可見光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在453nm處吸收度顯著降低。中藥藥物分析方法第25頁

2）選取日光下照射30分鐘或在紅外燈下照射4小時(shí)測ΔA值。

3）精密稱取膽紅素2mg于50ml棕色量瓶中，加入適量冷(10℃以下)酸性氯仿(150ml氯仿中含0.05ml濃鹽酸)，于冰水浴中超聲振蕩20分鐘，稀釋至刻度，制成貯備液。準(zhǔn)確吸收0，4、0．8、1，2、1.6、2.0ml貯備液于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，測其光照前后在453nm處吸收度?；貧w方程膽紅素在酸性氯仿溶液中吸收光譜為ΔA=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。a．光照前b．光照后除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光。中藥藥物分析方法第26頁

4）分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸空白樣品對照液，在453nm處測得各自光照前后A值，計(jì)算ΔA。試驗(yàn)表明三種成藥ΔA值為零或幾乎為零。說明其它干擾組分在以上光照條件下不干擾膽紅素測定。

5）精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各60mg，牛黃消炎丸120mg置10ml帶塞試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振蕩20分鐘，過濾，棄去初濾液，測續(xù)濾液光照前后A值，算出ΔA值。由回歸方程算得樣品含量。

本法加樣回收率：六應(yīng)丸為98.8％，RSD=1.8％；六神丸為100.7％，RSD=2.2％；牛黃消炎丸為93.0％，RSD＝1.1％。中藥藥物分析方法第27頁６、紫外光譜法中對儀器和試劑要求（1）儀器校正和檢定：包含波長精度、吸收度準(zhǔn)確性、雜散光等。（2）對溶劑要求：用1cm石英池盛裝溶劑，以空氣為空白，測定其吸光度，溶劑和吸收池吸光度在220nm—240nm范圍內(nèi)不得超出

0.40；在241nm—250nm范圍內(nèi)不得超出

0.20；在251nm—300nm范圍內(nèi)不得超出

0.10；300以上不得超出0.05。中藥藥物分析方法第28頁紫外分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測器信號處理及顯示中藥藥物分析方法第29頁第四節(jié)熒光分析法中藥藥物分析方法第30頁1、分子熒光產(chǎn)生

當(dāng)處于基態(tài)單線態(tài)分子吸收了一定頻率紫外可見光后，能夠躍遷到激發(fā)單線態(tài)各個(gè)不一樣能級，然后經(jīng)過振動(dòng)弛豫抵達(dá)第一激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級，假如以發(fā)射光量子方式，躍遷回到基態(tài)各個(gè)不一樣振動(dòng)能級，即產(chǎn)生熒光。中藥藥物分析方法第31頁2、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系及其影響原因

熒光與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系

分子熒光產(chǎn)生必須同時(shí)具備2個(gè)條件：

物質(zhì)分子必須含有能吸收一定頻率

紫外－可見光特定結(jié)構(gòu)和有較高熒光量子效率

影響原因

溫度、溶劑粘度、極性和溶液PH值、熒光猝滅劑、散射光干擾。中藥藥物分析方法第32頁3、熒光光譜及其特點(diǎn)（1）熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜

測定樣品對每一波長激發(fā)光所發(fā)射熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，得熒光物質(zhì)激發(fā)光譜。

發(fā)射光譜

從激發(fā)光譜上可找到發(fā)生熒光最強(qiáng)時(shí)激發(fā)光波長，以此進(jìn)行激發(fā)，將物質(zhì)發(fā)射熒光經(jīng)過單色器分光，測定每一個(gè)波長熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對熒光波長作圖，得熒光光譜。中藥藥物分析方法第33頁（2）熒光光譜特點(diǎn)

熒光光譜與其激發(fā)光譜含有鏡像特點(diǎn)。普通熒光波長比激發(fā)光波長要長些。中藥藥物分析方法第34頁4、定量分析方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

以熒光強(qiáng)度F對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C作工作曲線（或回歸方程）。在相同條件下測定試驗(yàn)樣溶液熒光強(qiáng)度，由工作曲線（或回歸方程）求出試樣中熒光物質(zhì)含量。中藥藥物分析方法第35頁

（2）百分比法

取已知量對照品，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液（Cs），測定其熒光強(qiáng)度（Fs），然后在相同條件下測定試樣溶液熒光強(qiáng)度（Fx），按百分比關(guān)系計(jì)算試樣中熒光物質(zhì)含量。常見空白校正。中藥藥物分析方法第36頁5、熒光分光光度計(jì)（1）儀器結(jié)構(gòu)

激發(fā)光原、樣品池、檢測器、濾光片或單色器。（2）儀器類型目視熒光計(jì)、光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)

中藥藥物分析方法第37頁二、熒光分析儀器中藥藥物分析方法第38頁6、應(yīng)用與示例直接熒光法：中藥成份中有本身含有熒光特征，可經(jīng)提取分離后，用直接法測定?；瘜W(xué)誘導(dǎo)熒光法：利用氧化還原、水解、縮合、配合、光化學(xué)反應(yīng)等化學(xué)方法，使一些本身不能產(chǎn)生熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒饣衔铮瑥亩脽晒夥y定。制備熒光衍生物：對于無熒光或熒光較弱物質(zhì)可選擇適當(dāng)熒光試劑與其生成含有特異熒光衍生物，再進(jìn)行測定。熒光猝滅法：利用一些物質(zhì)能夠使熒光物質(zhì)熒光猝滅性質(zhì)，間接地測定其含量。中藥藥物分析方法第39頁第五節(jié)原子吸收分光光度法中藥藥物分析方法第40頁1、原子吸收與發(fā)射

原子是由帶正電荷原子核和帶負(fù)電荷電子所組成，核外電子按一定量子軌道繞核旋轉(zhuǎn)，這些軌道呈。分立層狀結(jié)構(gòu)，每層含有各自確定能量，稱為原子能級或量子態(tài)。離核越遠(yuǎn)能級能量越高。通常情況下，電子都處于各自能量最低能級上，整個(gè)原子能量最低稱為基態(tài)，基態(tài)原子最穩(wěn)定。中藥藥物分析方法第41頁

當(dāng)基態(tài)原子受到外界能量(輻射)作用時(shí)，電子就可能吸收能量而向高能級軌道躍遷，此過程就是原子吸收過程。處于高能態(tài)原子稱為激發(fā)態(tài)原子。激發(fā)態(tài)原子很不穩(wěn)定，在極短時(shí)間內(nèi)(10-8秒左右)，電子又會(huì)從高能態(tài)躍遷回至基態(tài)，同時(shí)將所吸收能量以光輻射形式釋放出來，發(fā)射對應(yīng)光譜線，這就是原子發(fā)射過程。中藥藥物分析方法第42頁2、原子量子能級和能級圖（1）光譜項(xiàng)在原子光譜學(xué)中，原子能級普通用光譜項(xiàng)符號nMLJ表示。光譜項(xiàng)用N、L、S、J四個(gè)量子數(shù)來表征。中藥藥物分析方法第43頁n是價(jià)電子主量子；表示電子層，決定電子能量。L是總角量子數(shù)，其數(shù)值為外層價(jià)電子角量子數(shù)l矢量和，即L=∑li。取值0，1，2，3…通常分別用S、P、D、F..表示。l是角量子數(shù)，電子層形狀。S是總自旋量子數(shù)，其數(shù)值為各價(jià)電子自旋量子數(shù)s矢量和，即S=∑si，

J是內(nèi)量子數(shù)。由L和S耦合結(jié)果，數(shù)值為二者矢量和，即J=L+S。中藥藥物分析方法第44頁（2）能級圖

元素原子能級通常以原子外層電子能級圖來表示?？v坐標(biāo)表示原子能量E(ev)，將基態(tài)原子能量定為E=0，能級之間連線表示價(jià)電子在對應(yīng)能級之間躍遷時(shí)產(chǎn)生原子光譜線，橫坐標(biāo)是用光譜支項(xiàng)表示原子實(shí)際所處能級。中藥藥物分析方法第45頁3、原子吸收線輪廓及影響原因（1）原子吸收線輪廓及表征所謂譜線輪廓是指譜線強(qiáng)度按波長有一分布值。表征：吸收線頻率、半寬度、強(qiáng)度中藥藥物分析方法第46頁（2）影響原子吸收線變寬原因①自然變寬②熱變寬③壓力變寬④其它變寬中藥藥物分析方法第47頁4、原子吸收與原子濃度關(guān)系及定量方法積分吸收系數(shù)峰值吸收系數(shù)原子吸收與原子濃度關(guān)系中藥藥物分析方法第48頁5、原子吸收分光光度計(jì)（1）結(jié)構(gòu)光源原子化器分光系統(tǒng)檢測系統(tǒng)光源檢測原子化器分光原子化器分光光源檢測檢測中藥藥物分析方法第49頁（2）光源燈光源功效是發(fā)射被測元素基態(tài)原子所吸收特征共振輻射。對光源基礎(chǔ)要求是：發(fā)射輻射波長半寬度要顯著小于吸收線半寬度、輻射強(qiáng)度足夠大、穩(wěn)定性好、使用壽命長。當(dāng)前最能滿足上述要求銳線光源是空心陰極燈。中藥藥物分析方法第50頁中藥藥物分析方法第51頁中藥藥物分析方法第52頁（3）原子化器原子化器功效是提供能量，使試樣干燥、蒸發(fā)和原子化。入射光束在這里被基態(tài)原子吸收，所以也可把它視為“吸收池”。對原子化器基礎(chǔ)要求：必須含有足夠高原子化效率；必須含有良好穩(wěn)定性和重現(xiàn)形；操作簡單及低干擾水平等。常見原子化器有火焰原子化器和非火焰原子化器。中藥藥物分析方法第53頁①火焰原子化器火焰原子化法中，常見是預(yù)混合型原子化器它是由霧化器(nebulizer)、霧化室(spraychamber)和燃燒器(burner)三個(gè)別組成。用火焰使試樣原子化是當(dāng)前廣泛應(yīng)用一個(gè)方式。它是將液體試樣經(jīng)噴霧器形成霧粒，這些霧粒在霧化室中與氣體（燃?xì)馀c助燃?xì)猓┚鶆蚧旌?，除去大液滴后，再進(jìn)入燃燒器形成火焰。此時(shí)，試液在火焰中產(chǎn)生原子蒸氣。中藥藥物分析方法第54頁中藥藥物分析方法第55頁②石墨爐原子化器石墨爐原子化法過程是將試樣注入石墨管中間位置，用大電流經(jīng)過石墨管以產(chǎn)生高達(dá)-3000℃高溫使試樣經(jīng)過干燥、蒸發(fā)和原子化。石墨爐基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包含：石墨管（杯）(graphitetube)、爐體（保護(hù)氣系統(tǒng)）、電源等三個(gè)別組成。工作是經(jīng)歷干燥(dryness)、灰化(incineration)、原子化和凈化(depuration)等四個(gè)階段，即完成一次分析過程。中藥藥物分析方法第56頁中藥藥物分析方法第57頁中藥藥物分析方法第58頁（4）其它系統(tǒng)及附件單色器由入射和出射狹縫、反射鏡和色散元件組成。色散元件普通為光柵。單色器可將被測元素共振吸收線與鄰近譜線分開。檢測器：檢測系統(tǒng)主要由檢測器、放大器、對數(shù)變換器、指示儀表。中藥藥物分析方法第59頁中藥藥物分析方法第60頁（5）原子吸收分光光度計(jì)類型單光束原子吸收分光光度計(jì)雙光束原子吸收分光光度級中藥藥物分析方法第61頁6.原子吸收分析方法及應(yīng)用（1）原子吸收定量分析方法

校準(zhǔn)曲線法配制一組含有不一樣濃度被測元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在與試樣測定完全相同條件下，按濃度由低到高次序測定吸光度值。繪制吸光度對濃度校準(zhǔn)曲線。測定試樣吸光度，從校準(zhǔn)曲線上用內(nèi)插法求出被測元素含量。中藥藥物分析方法第62頁ACCxAxO中藥藥物分析方法第63頁標(biāo)準(zhǔn)加入法分取幾份相同量被測試液，分別加入不一樣量被測元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一份不加被測元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終稀釋至相同體積，使加入標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0，CS、2CS

、3CS…，然后分別測定它們吸光度，繪制吸光度對濃度校準(zhǔn)曲線，再將該曲線外推至與濃度軸相交。交點(diǎn)至坐標(biāo)原點(diǎn)距離Cx即是被測元素經(jīng)稀釋后濃度。中藥藥物分析方法第64頁中藥藥物分析方法第65頁7、原子吸收干擾及其抑制原子吸收光譜法主要干擾有物理干擾、化學(xué)干擾、光譜干擾、電離干擾、和背景干擾等。中藥藥物分析方法第66頁物理干擾（physicalinterference）

物理干擾是指試液與標(biāo)準(zhǔn)溶液物理性質(zhì)有差異而產(chǎn)生干擾。如粘度、表面張力或溶液密度等改變，影響樣品霧化和氣溶膠抵達(dá)火焰?zhèn)魉偷纫l(fā)原子吸收強(qiáng)度改變而引發(fā)干擾。消除方法：配制與被測試樣組成相近標(biāo)準(zhǔn)溶液或采取標(biāo)準(zhǔn)加入法。若試樣溶液濃度高，還可采取稀釋法。中藥藥物分析方法第67頁化學(xué)干擾（Chemicalinterference）

化學(xué)干擾是因?yàn)楸粶y元素原子與共存組份發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成穩(wěn)定化合物，影響被測元素原子化，而引發(fā)干擾。電離是化學(xué)干擾又一主要形式。原子失去一個(gè)或幾個(gè)電子后形成離子，不產(chǎn)生吸收，所以個(gè)別基態(tài)原子電離會(huì)使吸收強(qiáng)度減弱。這種干擾是一些元素所特有，對于電離電位＜6eV元素，在火焰中輕易電離(表8—6)，火焰溫度越高，干擾越嚴(yán)重。這種現(xiàn)象在堿金屬和堿士金屬中尤其顯著。中藥藥物分析方法第68頁消除化學(xué)干擾方法：

選擇適當(dāng)原子化方法加入釋放劑加入保護(hù)劑加入消電離劑加入緩沖劑加入基體改進(jìn)劑中藥藥物分析方法第69頁電離干擾在高溫條件下，原子會(huì)電離，使基態(tài)原子數(shù)降低，吸光度下降，這種干擾稱為電離干擾。

消除方法是加入過量消電離劑。消電離劑是比被測元素電離電位低元素，相同條件下消電離劑首先電離，產(chǎn)生大量電子，抑制被測元素電離。中藥藥物分析方法第70頁光學(xué)干擾光譜線干擾

是指原子光譜對分析線干擾，分為非吸收線未能被單色器分離和吸收線重合。背景干擾

是一個(gè)非原子性吸收，包含分子吸收干擾和光散射、折射。中藥藥物分析方法第71頁第六節(jié)高效液相色譜法中藥藥物分析方法第72頁1、基礎(chǔ)原理（1）基礎(chǔ)理論和術(shù)語色譜法是一個(gè)分離技術(shù)?；旌衔锓蛛x過程：試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中兩相間不停進(jìn)行著分配。一相固定不動(dòng)，稱為固定相。另一相是攜帶試樣混合物流過固定相流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。中藥藥物分析方法第73頁

原理：是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行一個(gè)連續(xù)屢次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不一樣而引發(fā)排阻作用差異使不一樣溶質(zhì)得以分離。

中藥藥物分析方法第74頁①基線無試樣經(jīng)過檢測器時(shí)，檢測到信號即為基線。②保留值

A.時(shí)間表示保留值保留時(shí)間(tR)：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需時(shí)間；（動(dòng)畫）

死時(shí)間(tM)：不與固定相作用氣體(如空氣)保留時(shí)間；調(diào)整保留時(shí)間（tR

＇）：tR＇=tR－tM

中藥藥物分析方法第75頁B.用體積表示保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×qvqv為柱出口處載氣流量，單位：mL/min。死體積（VM）：

VM=tM×qv

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

中藥藥物分析方法第76頁③相對保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)相關(guān)，與其它色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分選擇性。中藥藥物分析方法第77頁④區(qū)域?qū)挾?/p>

衡量色譜峰寬度參數(shù)，三種表示方法：A.標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度二分之一。B.半峰寬(Y1/2)：色譜峰高二分之一處寬度Y1/2=2.354。C.峰底寬(Wb)：Wb=4。中藥藥物分析方法第78頁（2）分離度及其影響原因塔板理論和速率理論都難以描述難分離質(zhì)正確實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組分能夠被完全分離。難分離物質(zhì)正確分離度大小受色譜過程中兩種原因綜合影響：保留值之差──色譜過程熱力學(xué)原因；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程動(dòng)力學(xué)原因。中藥藥物分析方法第79頁

色譜分離中四種情況如圖所表示：①柱效較高，ΔK(分配系數(shù))較大，完全分離。②ΔK不是很大，柱效較高，峰較窄，基礎(chǔ)分離。③柱效較低，ΔK較大，但分離不好。④ΔK小，柱效低，分離效果更差。中藥藥物分析方法第80頁分離度表示式：R=0.8：兩峰分離程度可達(dá)89%；R=1.0：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離標(biāo)準(zhǔn)）中藥藥物分析方法第81頁分離度基礎(chǔ)關(guān)系式：中藥藥物分析方法第82頁分離度與柱效

分離度與柱效(n)平方根成正比，r21一定，增加柱效，可提升分離度。但經(jīng)過增加柱長來增加n使組分保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長。分離度與r21

增大r21是提升分離度最有效方法，計(jì)算可知，在相同分離度下，當(dāng)r21增加一倍，需要n有效減小10000倍。增大r21最有效方法是選擇適當(dāng)固定液。中藥藥物分析方法第83頁2、主要分離分析方法（1）吸附色譜法（2）正相色譜法（3）反相色譜法①普通反相色譜法②反相離子對色譜③反相離子抑制色譜中藥藥物分析方法第84頁3、高效液相色譜儀（1）高壓輸出系統(tǒng)（2）進(jìn)樣系統(tǒng)（3）分離系統(tǒng)（4）檢測系統(tǒng)（5）統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)系統(tǒng)中藥藥物分析方法第85頁中藥藥物分析方法第86頁4、高效液相色譜法試驗(yàn)條件選擇（1）色譜柱選擇硅膠柱：用于苯、萘、聯(lián)苯及菲混合物分離。ODS（C18）柱：同硅膠柱，但需乙醇配制。氰基與氨基柱：用于偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯混合物分離。強(qiáng)堿性陰離子交換柱：可用于鄰、間、對苯二甲酸混合物分離。強(qiáng)酸性陽離子交換柱：用于芳胺、吡啶及8-羥基喹啉混合物分離。中藥藥物分析方法第87頁(2)流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí)，溶劑極性是選擇主要依據(jù)，采取正相液-液分配分離時(shí)，首先選擇中等極性溶劑，若組分保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加，也可在低極性溶劑中，逐步增加其中極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常見溶劑極性次序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)中藥藥物分析方法第88頁（3）前處理方法液-液萃取分離(LLE)有機(jī)溶劑直接萃取法與離子對萃取法。樣品萃取后需將溶液相過濾，加無水硫酸鈉干燥、蒸發(fā)、濃縮、定容后才可使用。液-固萃取分離(LSE)

方法介紹：本法是用液相色譜原理來處理樣品一個(gè)方法。在一小柱中裝上固體萃取劑，將樣品上柱后，藥品在柱上保留，用選好溶劑清洗除去雜質(zhì)后，再將藥品從柱上洗脫下來。

親脂性鍵合相硅膠：

C18是最常見固體萃取劑，適合用于萃取、純化水基質(zhì)體液中親脂性藥品。中藥藥物分析方法第89頁（4）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)通常包含理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾銀子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義參數(shù)中藥藥物分析方法第90頁（5）應(yīng)用示例定性分析方法：（i）保留時(shí)間

保留時(shí)間(tR)

死時(shí)間(t0)：在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間(t′R)：t′R＝tR-t0

在試驗(yàn)條件一定時(shí)，調(diào)整保留時(shí)間只決定于組分性質(zhì)。中藥藥物分析方法第91頁（ii）保留體積

保留體積(VR)：VR=tRFc，F(xiàn)c為流動(dòng)相流速

死體積(Vo)：調(diào)整保留體積()＝VR-Vo中藥藥物分析方法第92頁定量分析方法

HPLC定量分析參數(shù)是色譜峰高和峰面積，定量依據(jù)是樣品中組分量(或濃度)與峰高或峰面積成正比。常見定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和內(nèi)加法。中藥藥物分析方法第93頁（i）峰高和峰面積

正常峰面積：A=1.065Wh/2×h

不對稱峰面積可用平均峰寬來計(jì)算：

A＝1/2·(W0.15h+W0.85h)×h

普通說來，當(dāng)分離度小或流量波動(dòng)時(shí)，常見峰高定量。當(dāng)峰形不正或色譜柱超負(fù)荷時(shí)，用峰面積定量。中藥藥物分析方法第94頁（ii）外標(biāo)法用與待測組分同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品作對照品，以對照品量對比求算試樣含量方法稱為外標(biāo)法。外標(biāo)法是HPLC常見定量分析方法之一。分為外標(biāo)工作曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法中藥藥物分析方法第95頁（iii）內(nèi)標(biāo)法選擇適宜物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，以待測組分和內(nèi)標(biāo)物峰高比或峰面積比求算試樣含量方法稱為內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法關(guān)鍵是選擇適當(dāng)內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)法能夠分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子法等。中藥藥物分析方法第96頁（iiii）內(nèi)加法

將待測組分i純品加至待測樣品溶液中，測定增加純品后溶液比原樣品溶液中i組分峰面積增量，求算i組分含量。內(nèi)加法定量分析計(jì)算公式以下：

mi=（Ai/ΔAi）×Δmi

式中Δmi是純物質(zhì)i加入量，ΔAi是對應(yīng)增加峰面積。中藥藥物分析方法第97頁第七節(jié)薄層掃描分析法中藥藥物分析方法第98頁1、基礎(chǔ)原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點(diǎn)移動(dòng)，測定A-l或F-l曲線。依據(jù)薄層掃描測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。

中藥藥物分析方法第99頁①薄層吸收掃描法

光源：鎢燈和氘燈；

靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇適當(dāng)波長進(jìn)行測定，其靈敏度可達(dá)ng級；

適用范圍：適合用于在可見、紫外區(qū)有吸收物質(zhì)，及經(jīng)過色譜前或色譜后衍生成上述化合物樣品組分。

中藥藥物分析方法第100頁②薄層熒光掃描法

光源：氙燈或汞燈。

靈敏度：最低可測到10-50pg。

適用范圍：適合于本身含有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光物質(zhì)測定。

中藥藥物分析方法第101頁2、定量分析方法

①方法學(xué)考查②常見定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。中藥藥物分析方法第102頁外標(biāo)法

外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常見定量方法，方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。

A.外標(biāo)一點(diǎn)法

工作曲線經(jīng)過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。計(jì)算公式為：

C=F1·A

式中：C為組分重量或濃度，A為測得該組分峰面積，F(xiàn)1為直線斜率或百分比常數(shù)。中藥藥物分析方法第103頁B.外標(biāo)二點(diǎn)法

工作曲線不經(jīng)過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量。計(jì)算公式為：

C=F1A+F2式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線斜率或百分比常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動(dòng)算出。

中藥藥物分析方法第104頁內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量定量方法。

中藥藥物分析方法第105頁回歸曲線定量法A.將不一樣濃度（或不一樣量）標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開、掃描;B.由計(jì)算機(jī)對所測得峰面積及對應(yīng)點(diǎn)樣量進(jìn)行線性或非線性回歸;C.直接由回歸方程或回歸曲線計(jì)算供試液含量方法。

中藥藥物分析方法第106頁追加法

追加法適合用于成份復(fù)雜樣品定量分析，既含有內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)又不需要內(nèi)標(biāo)物，方法與HPLC內(nèi)加法類似。中藥藥物分析方法第107頁中藥藥物分析方法第108頁第八節(jié)氣相色譜法中藥藥物分析方法第109頁原理氣相色譜法（GC）是將汽化后試樣由載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱，依據(jù)各組分在流動(dòng)相和固定相間作用不一樣而分離，并隨載氣依次流出氣譜柱，經(jīng)檢測器檢測，利用保留值進(jìn)行定性，色譜峰面積或峰高進(jìn)行定量分析方法。中藥藥物分析方法第110頁1、試驗(yàn)條件選擇分離條件選擇固定相

柱溫載氣中藥藥物分析方法第111頁（1）固定相選擇普通按極性相同標(biāo)準(zhǔn)來選擇。①分離非極性化合物，應(yīng)選非極性固定液，基礎(chǔ)上是按沸點(diǎn)次序出柱，低沸點(diǎn)先出柱，若有極性組分，則相同沸點(diǎn)極性組分先出柱。②中等極性化合物，選中等極性固定液，基礎(chǔ)上仍按沸點(diǎn)次序出柱，但對沸點(diǎn)相同極性與非極性組分，誘導(dǎo)力起主要作用，非極性組分先出柱。中藥藥物分析方法第112頁③極性化合物，選取極性固定液，組分按極性次序出柱，極性弱組分先出柱。④分離復(fù)雜樣品，若組分沸點(diǎn)差異較大，可選非極性固定液，若極性差異較大，可選擇極性固定液。⑤分離氫鍵型組分，應(yīng)選擇氫鍵型固定液，組分按其與固定液形成氫鍵能力大小出柱，能力弱先出柱。中藥藥物分析方法第113頁（2）柱溫及固定液與擔(dān)體配比選擇①高沸點(diǎn)樣品（沸點(diǎn)300℃～400℃），采取1％~5％低固定液配比，柱溫200℃～250℃。②沸點(diǎn)為200℃～300℃樣品，采取5％～10％固定液配比柱溫150cm/s～180℃。③沸點(diǎn)為100℃～~200℃樣品，采取10％～15％固定液配比，柱溫選各組分平均沸點(diǎn)2/3左右。④氣體等低沸點(diǎn)采取15%～25%高固定相配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50℃下進(jìn)行分析。⑤對于寬沸程樣品，需選擇程序升溫方法進(jìn)行。

中藥藥物分析方法第114頁（3）載氣選擇

載氣選擇主要從對峰展寬（柱效）、柱壓和對檢測靈敏度影響三方面考慮，當(dāng)采取低流速時(shí)，宜用分子量較大N2，當(dāng)高流速時(shí)，宜用分子量低、粘度小H2或He。當(dāng)色譜柱較長時(shí),宜采取H2，當(dāng)使用TCD時(shí)，宜用H2或He，F(xiàn)ID、ECD等普通常見N2。通常載氣流速可為20～80ml/min，可經(jīng)過試驗(yàn)選擇最正確流速，但為縮短分析時(shí)間，載氣流通常高于最正確流速。中藥藥物分析方法第115頁(4)其它條件選擇①氣化室溫度氣化室溫度取決于樣品揮發(fā)性、沸點(diǎn)及進(jìn)樣量，普通采取樣品沸點(diǎn)或稍高一點(diǎn)溫度，確保瞬間溶化，但不要超出沸點(diǎn)50℃以上，以防樣品分解，普通氣化室溫度應(yīng)高于柱溫30℃～50℃。②檢測室溫度檢測室溫度普通高于柱溫30℃～50℃或等于汽化室溫為宜，以預(yù)防流出物在檢測器中冷凝而對其造成污染。③進(jìn)樣