免疫學(xué)技術(shù)演示文稿

免疫學(xué)技術(shù)演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)經(jīng)典的免疫學(xué)方法：一、凝集反應(yīng)（agglutination）細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊的反應(yīng)。1、直接凝集反應(yīng)2、間接凝集反應(yīng)3、間接凝集抑制反應(yīng)目前二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)二、沉淀反應(yīng)（precipitation）血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物的反應(yīng)。1、單向免疫擴(kuò)散（singleimmunodiffusion）2、雙向免疫擴(kuò)散（doubleimmunodiffusion）3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis）5、免疫濁度測(cè)定（immunonephelometry）目前四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)免疫濁度測(cè)定：可溶性Ag+Ab，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中快速形成一定的AgAb復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。透射比濁法散射比濁法速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法目前十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)一定要保持抗體過(guò)量，以維持抗原－抗體復(fù)合物的相對(duì)不溶解性。目前十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)該方法的分析范圍主要檢測(cè)的是血漿、體液中特定蛋白系列。如Ig、補(bǔ)體、血漿蛋白、炎性反應(yīng)蛋白、一些小分子量的治療性藥物濃度等。目前十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)第一節(jié)

免疫學(xué)檢測(cè)常用標(biāo)記技術(shù)目前十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）指用熒光素、放射性核素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)（膠體金、鐵蛋白）作為示蹤劑標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原—抗體反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、特異性、快速，能定性、定量、定位測(cè)定，易于觀察結(jié)果并適合自動(dòng)化檢測(cè)。總體分為：免疫組化：定位檢測(cè)組織或細(xì)胞中的

Ag/Ab免疫測(cè)定：定量檢測(cè)液體標(biāo)本中的

Ag/Ab也可分為：熒光免疫技術(shù)，放射免疫技術(shù)，酶免疫技術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)及免疫金標(biāo)記技術(shù)等。目前十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)一、酶免疫技術(shù)基本原理：以酶標(biāo)記抗體（或抗原）用于免疫檢測(cè)，通過(guò)相應(yīng)底物被酶解后的顯色反應(yīng)，對(duì)標(biāo)本中的抗原/抗體進(jìn)行定量、定位分析。

標(biāo)記物：酶（催化底物：生物放大作用）特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便安全易行，容易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。目前十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）HRP來(lái)源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）組成的復(fù)合物。HRP常用的底物有：（1）鄰苯二胺（OPD）

OPD顯色后為橙黃色，加入終止液為棕黃色，可溶性產(chǎn)物，應(yīng)用最早，但配成溶液后穩(wěn)定性差，且有潛在的致癌性，顯色反應(yīng)需避光。（2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）

TMB經(jīng)酶作用呈蘭色，可溶性產(chǎn)物，加酸終止后黃色，穩(wěn)定性好，顯色反應(yīng)無(wú)需避光，無(wú)致突變作用。應(yīng)用最廣泛。但水溶性差。目前十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

2、堿性磷酸酶（AP）

AP從大腸桿菌或小牛腸粘膜中提取，菌源性活力小于小腸粘膜活力。AP價(jià)格較HRP高，穩(wěn)定性差，但敏感度高，空白值低。可催化對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黃色的對(duì)硝基酚，NaOH終止后黃色可穩(wěn)定存在一段時(shí)間（405nm）。目前十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

（二）酶免疫技術(shù)的分類(lèi)酶免疫組化

（EIH）

均相酶免疫測(cè)定（HEI）

酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定（EIA）

液相酶免疫測(cè)定（同RIA）目前十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）酶免疫測(cè)定（EIA）

1、均相酶免疫測(cè)定（HEI）特點(diǎn)：僅需將待測(cè)樣品、酶標(biāo)試劑和底物溶液混合，待抗原抗體反應(yīng)完成即可直接測(cè)定結(jié)果，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程都在均勻的液相中進(jìn)行。以酶放大免疫測(cè)定技術(shù)（EMIT）為例：

目前二十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2、非均相酶免疫測(cè)定（1）液相酶免疫測(cè)定（液相EIA）：同RIA：抗原、酶標(biāo)抗原、抗體相繼加入后，使反應(yīng)達(dá)到平衡，再加分離劑。（2）固相酶免疫測(cè)定（固相EIA）：AgAb反應(yīng)在固相載體的表面進(jìn)行，應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA）目前二十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)1）

ELISA

基本原理將抗原或抗體結(jié)合到固相載體的表面，并保持其免疫活性?？乖蚩贵w與酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，仍分別保持其免疫活性和酶活性。在固相載體上按照一定的步驟加入待測(cè)抗原或抗體及酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原，洗去未結(jié)合的游離物質(zhì)，加入酶的底物顯色，顏色的深淺與待測(cè)物質(zhì)含量呈相關(guān)性。目前二十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2）固相載體的種類(lèi)A、塑料制品聚苯乙烯：蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵或物理吸附結(jié)合到載體表面，可制成小試管、小珠、微量反應(yīng)板的形式

專(zhuān)用于ELISA的微量反應(yīng)板——ELISA板（812=96孔）B、微顆粒高分子單體聚合成的微球或顆粒，帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能基團(tuán)，易于化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大。反應(yīng)時(shí)可均勻的分散到整個(gè)反應(yīng)溶液中，反應(yīng)速度快。其中可包裹磁性物質(zhì)，制成磁化微顆粒，使分離可在磁板中完成，自動(dòng)化分析。C、膜載體

NC膜（硝酸纖維素膜）、玻璃纖維素膜、尼龍膜等微孔濾膜。非共價(jià)鍵吸附Ab/Ag，吸附能力強(qiáng)。廣泛應(yīng)用于斑點(diǎn)-ELISA等。目前二十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

3）ELISA方法類(lèi)型及反應(yīng)原理A、雙抗體夾心法

此法是檢測(cè)大分子抗原的常用方法。上述方法亦可改為雙位點(diǎn)一步法，使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。注意鉤狀效應(yīng)。目前二十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)B、間接法

此法是測(cè)定抗體的常用方法?？梢杂靡环N酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)多種抗體。目前二十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前二十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)C、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法

可用于測(cè)定小分子抗原或半抗原及抗體。以檢測(cè)抗原為例，待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待測(cè)抗原含量呈反比。目前二十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

D、捕獲法——最常用于檢測(cè)IgM抗體

包被抗人IgM鏈+待測(cè)標(biāo)本IgM類(lèi)抗體全被固相抗體捕獲洗滌+特異性抗原（針對(duì)待測(cè)IgM的相應(yīng)抗原）與固相上特異性IgM結(jié)合+酶標(biāo)抗體（針對(duì)特異性Ag的）+底物顯色顯色表示有特異性IgM。目前二十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

E、BAS-ELISA

生物素（B）-親和素（A）系統(tǒng)（biotinavidinsystem，BAS）是以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，它們的結(jié)合迅速、專(zhuān)一、穩(wěn)定，并具有多級(jí)放大效應(yīng)。應(yīng)用生物素親和素放大系統(tǒng)的ELISA，使反應(yīng)信號(hào)放大，檢測(cè)靈敏度提高。

目前二十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)1個(gè)親和素（鏈霉親和素）可結(jié)合四個(gè)生物素衍化物1個(gè)抗體可結(jié)合多個(gè)B，與蛋白質(zhì)-NH2結(jié)合形成肽鍵，-NH2越多，標(biāo)記B越多。

E

BAg?

E—B—A—B—EBAbB

BB

EE—B—A—B—E目前三十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)BAS-ELISA包括：

ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BA-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BAB-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

例如：BAB-ELISA（雙抗體夾心法）：

固相Ab+待檢Ag+（Ab-B）+A+B-E+底物顯色目前三十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）目前三十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（四）酶免疫組化（EIH）原理：以酶標(biāo)記抗體與用于相應(yīng)抗原反應(yīng)，通過(guò)底物被酶解顯色以示蹤抗原-抗體結(jié)合物存在的部位。酶免疫組化染色標(biāo)本可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，并能長(zhǎng)期保存。此外，作為辣根過(guò)氧化物酶底物的二氨基聯(lián)苯胺（DAB），其分解產(chǎn)物為不溶性，適于鏡下觀察。目前三十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)1、直接法組織標(biāo)本待測(cè)抗原+酶標(biāo)記抗體——DAB顯色2、間接法組織標(biāo)本待測(cè)抗原+Ab1+酶標(biāo)-二抗使用一種酶標(biāo)抗體可檢測(cè)多種抗原。敏感性較直接法高，但低于PAP法。目前三十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3、生物素-親和素法將親和素（A）與生物素（B）系統(tǒng)應(yīng)用于酶免疫組化包括：ABC法（直接法、間接法）BAB法（直接法、間接法）BA法（直接法、間接法）目前三十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3.

1）ABC法直接ABC法:玻片Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-AB*C特點(diǎn):將BAB法中的A先與B·E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC間接ABC法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BABCAg-Ab1-Ab2·B-AB*C目前三十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2）BAB法（橋聯(lián)親合素-標(biāo)記生物素法—BRAB）直接BAB法:組織切片或細(xì)胞涂片Ag+B·AbAg-Ab·BA

Ag-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特點(diǎn)：以游離A分別連接B·Ab和B·E間接BAB法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合組織切片或細(xì)胞涂片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BAAg-Ab1-Ab2·B-AB·EAg-Ab1-Ab2·B-A-B·E目前三十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3）BA法（標(biāo)記親合素-生物素法——LAB法）直接BA（或LAB）法玻片Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點(diǎn)：以A·E/SA·E代替BAB法中的A，省卻了加B·E的步驟間接BA（或LAB）法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BA·EAg-Ab1-Ab2·B-A·E目前三十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

BAS實(shí)驗(yàn)方法及反應(yīng)層次

方法反應(yīng)層次

直接法BAAg—(Ab-B)—A*BABAg—(Ab-B)—A—B*ABCAg—(Ab-B)—AB*C

間接法BAAg—Ab1—(Ab2-B)—A*

BABAg—Ab1—(Ab2-B)—A—B*

ABCAg—Ab1—(Ab2-B)—AB*C

Ag抗原；Ab-B生物素化抗體；

A親合素；A*標(biāo)記親合素；

B生物素；B*標(biāo)記生物素；

Ab1第一抗體；Ab2第二抗體;Ab2-B生物素化第二抗體目前三十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)4、過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidasecomplex，PAP）法和堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（alkalinephosphatase-antialkalinephosphatase，APAAP）法

原理：應(yīng)用抗酶抗體與酶結(jié)合，形成可溶性、穩(wěn)定的酶-抗酶抗體復(fù)合物。此法優(yōu)點(diǎn)是：未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，故避免了抗體和酶活性降低，并省去酶標(biāo)記抗體需純化的繁復(fù)過(guò)程。目前四十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)二、熒光免疫技術(shù)（fluoroimmunoassay）原理：以熒光素標(biāo)記的抗體或抗原，用于相應(yīng)抗原或抗體的分析鑒定。熒光免疫技術(shù)分為：免疫熒光顯微技術(shù)（熒光免疫組化）：用熒光抗體對(duì)細(xì)胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原（或抗體）進(jìn)行鑒定和定位檢測(cè)，可在熒光顯微鏡下直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，流式細(xì)胞術(shù)：進(jìn)行自動(dòng)分析檢測(cè)熒光免疫測(cè)定：用于檢測(cè)體液標(biāo)本中抗原或抗體。目前四十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）常用的熒光色素1、異硫氰酸熒光素（FITC）

橙黃色/黃色粉末，發(fā)出黃綠色熒光。最大吸收峰490—495nm，最大發(fā)射峰520—530nm，含異硫氰基N=C=S。應(yīng)用最多的熒光素。2、四乙基羅丹明（RB200）

橘紅色粉末，發(fā)出橘紅色或橙色熒光。最大吸收峰570nm，最大發(fā)射峰595—600nm。含磺酸基。與FITC做雙標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?、藻紅蛋白（R-RE）發(fā)出橙色熒光，最大吸收峰565nm，最大發(fā)射峰575nm，可與FITC共用488nm激發(fā)光，可用于流式細(xì)胞儀的雙標(biāo)記。目前四十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）免疫熒光顯微技術(shù)1、方法及原理1）直接法應(yīng)用特異性熒光抗體直接檢查標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。2）間接法以特異性抗體（或待測(cè)抗體）為第一抗體，以熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體（標(biāo)記的抗抗體）為第二抗體，用于檢測(cè)抗原或抗體。目前四十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3）補(bǔ)體法此法是在間接法的第一步抗原-抗體反應(yīng)加入補(bǔ)體，使之與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體進(jìn)行示蹤。4）雙標(biāo)記法

此法用異硫氰酸熒光素（FITC）及羅丹明（TRITC）分別標(biāo)記不同抗體，進(jìn)行同一標(biāo)本的熒光染色，若有兩種相應(yīng)抗原存在，可同時(shí)見(jiàn)兩種（橙紅、黃綠）熒光。目前四十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

2、熒光顯微鏡檢查1）染色標(biāo)本盡可能立即觀察結(jié)果。2）鏡下觀察時(shí)同一標(biāo)本區(qū)觀察時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)。3）通風(fēng)較好的暗室中進(jìn)行。4）油鏡檢查時(shí)用無(wú)熒光鏡油，先觀察對(duì)照，再看待測(cè)標(biāo)本。

目前四十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確分析和自動(dòng)檢測(cè)，并可對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞進(jìn)行分選和收集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，故成為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)新技術(shù)。

目前四十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)1、基本概念與原理

FCM是一種分析單個(gè)微粒（如細(xì)胞、微生物和人工合成微球等）物理和化學(xué)特性的技術(shù)，其特點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、客觀，能定量。FCM的原理：懸浮在液體中的分散細(xì)胞單個(gè)地依次通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)產(chǎn)生電信號(hào)，從而可快速對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)和分析，并可從整個(gè)群體中分選出特定的細(xì)胞亞群。目前四十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前四十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2、流式細(xì)胞術(shù)在免疫細(xì)胞研究中的應(yīng)用1）細(xì)胞表型分析表型分析可用于免疫細(xì)胞鑒定、計(jì)數(shù)和功能評(píng)價(jià)。2）細(xì)胞功能檢測(cè)（1）細(xì)胞功能狀態(tài)和活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：包括檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性狀態(tài)、信息傳遞相關(guān)蛋白表達(dá)及相互作用等。目前四十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（2）細(xì)胞增殖：應(yīng)用活細(xì)胞染料5’-二醋酸羧基熒光素琥珀酸單胞菌酯（5’-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE）作為標(biāo)記物，建立了檢測(cè)細(xì)胞增殖的新技術(shù)。原理：CFSE能自動(dòng)穿過(guò)胞膜，與胞內(nèi)蛋白賴(lài)氨酸不可逆結(jié)合，并隨細(xì)胞分裂而倍減，借助FCM檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可判斷細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

目前五十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（3）細(xì)胞分化：借助胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（intracelluarcytokinestaining，ICCS），可應(yīng)用FCM檢測(cè)單細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的CK，從而判斷單一細(xì)胞亞群的分化和功能狀態(tài)。原理：應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑使胞內(nèi)合成的CK滯留在高爾基體；應(yīng)用透膜劑（saponin）使熒光標(biāo)記抗體可逆性穿透胞膜，以進(jìn)行胞內(nèi)染色。目前五十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（4）細(xì)胞毒效應(yīng)：通過(guò)檢測(cè)某些效應(yīng)分子（FasL、穿孔素和顆粒酶等）可判斷細(xì)胞毒效應(yīng)。（5）細(xì)胞凋亡：見(jiàn)下文。目前五十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（四）熒光免疫測(cè)定（FIA）1、熒光偏振免疫測(cè)定（FPIA）

該法主要用于小分子物質(zhì)（特別是藥物濃度）測(cè)定。原理：熒光素標(biāo)記的已知抗原+待測(cè)抗原+抗體——形成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，由于其分子量大，旋轉(zhuǎn)慢，在激發(fā)光照射下，吸收的偏振光多，發(fā)出的偏振熒光強(qiáng)，小分子游離標(biāo)記抗原旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱。因此，標(biāo)本中抗原濃度越高，形成的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物越少，發(fā)出的偏振熒光越弱。反之，發(fā)出的偏振熒光越強(qiáng)。目前五十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

2、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理：應(yīng)用具有較長(zhǎng)熒光壽命的鑭系螯合物（如銪）標(biāo)記抗原或抗體，并利用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測(cè)量時(shí)間，有效消除非特異性本底熒光的干擾，所得信號(hào)完全是鑭系螯合物發(fā)射的特異熒光，從而最大限度提高測(cè)定方法的靈敏度和特異性。

目前五十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前五十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3、酶免疫熒光測(cè)定（ELFIA）

原理：應(yīng)用具有潛在熒光的物質(zhì)作為酶的底物，經(jīng)過(guò)酶解反應(yīng)產(chǎn)生高強(qiáng)度熒光，可用熒光測(cè)量?jī)x進(jìn)行定量測(cè)定。目前五十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)三、放射免疫技術(shù)是以放射性核素作為示蹤劑的標(biāo)記免疫測(cè)定方法，其特點(diǎn)是將核素分析的高靈敏度與抗原-抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。

廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對(duì)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大的推動(dòng)作用。包括放射免疫測(cè)定（RIA）和免疫放射測(cè)定（IRMA）目前五十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）常用的放射性核素射線(xiàn)：131I、125I、51Cr、60Co射線(xiàn)：14C、3H、32P射線(xiàn)半衰期長(zhǎng)，易造成對(duì)環(huán)境的污染，比活性差，需液體閃爍儀。一般不用。目前五十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）放射免疫測(cè)定（RIA）

1、RIA基本原理以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag*）和檢品中待測(cè)的未標(biāo)記抗原（Ag）與固定量特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。若Ag*和Ab的量固定，二者結(jié)合所形成Ag*-Ab復(fù)合物受Ag含量制約。若反應(yīng)系統(tǒng)中Ag含量高，其對(duì)Ab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力即強(qiáng)，Ag-Ab復(fù)合物生成量增加，Ag*-Ab復(fù)合物則相對(duì)減少。因此，Ag*Ab復(fù)合物形成量與Ag含量間呈一定負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系。目前五十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)Ag*+AbAg*Ab+Ag*

+

Ag

AgAb+Ag

BFB0T

目前六十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2、RIA測(cè)定方法1）AgAb反應(yīng)2）B、F的分離加入PR試劑（二抗和PEG混合物，也可制成固相二抗（二抗與顆粒固相物連接）Ag*Ab1+Ab2——Ag*Ab1-Ab23）放射性強(qiáng)度的測(cè)定

——計(jì)數(shù)儀測(cè)上清/沉淀cpm，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（B/（B+F），B/F，B/B0）。亦可用計(jì)算機(jī)處理。目前六十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）免疫放射測(cè)定（IRMA）1、單位點(diǎn)IRMA是將待測(cè)抗原與過(guò)量標(biāo)記抗體直接反應(yīng)，然后加入固相的抗原免疫吸附劑與游離的標(biāo)記抗體結(jié)合經(jīng)離心去除沉淀物，測(cè)定上清液放射性強(qiáng)度，從而推算出檢品中待測(cè)抗原含量。2、雙位點(diǎn)IRMA測(cè)定固相上的cpm數(shù)目前六十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)四、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光技術(shù)與免疫反應(yīng)和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合的自動(dòng)化儀器分析技術(shù)，目前已趨替代RIA而成為免疫檢測(cè)廣泛采用的分析技術(shù)?？捎糜诙囗?xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。可測(cè)定內(nèi)分泌激素類(lèi)、腫瘤標(biāo)志物類(lèi)、心肌標(biāo)志物類(lèi)、病毒標(biāo)志物類(lèi)、治療性藥物濃度、骨代謝指標(biāo)和貧血類(lèi)等方面的檢測(cè)。

目前六十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）CLIA是以化學(xué)發(fā)光劑（如魯米諾、吖啶酯等）標(biāo)記抗體或抗原，免疫反應(yīng)完成后，直接引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。目前六十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）

CLEIA的抗原-抗體反應(yīng)步驟與酶免疫測(cè)定相同，僅酶促反應(yīng)所用的底物為發(fā)光劑，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。目前六十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（ECLIA）

ECLIA實(shí)際上是在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕RU(bpy)32+三丙胺（TPA）.目前六十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖目前六十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖目前六十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)五、免疫金標(biāo)記技術(shù)（immunogoldlabellingtechnique）氯金酸（HAuCl4）在還原劑（枸櫞酸三鈉）作用下被還原成原子金，聚合成特定大小的金顆粒懸液，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)——膠體金。是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原-抗體反應(yīng)。膠體金具有高電子密度，最初主要用于免疫電鏡技術(shù)，以后其應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)展。在免疫組化方面，膠體金標(biāo)記的抗體可直接用于檢測(cè)細(xì)胞表面和組織切片中的抗原或受體，并可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。在流式細(xì)胞術(shù)中，膠體金可作為多參細(xì)胞分析和分選的有效標(biāo)記物。目前六十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)常用的方法：1、免疫金（銀）染色法（IGS/IGSS）組織切片（抗原）+特異性抗體+膠體金標(biāo)記二抗+銀顯影劑，標(biāo)記物上的金顆粒催化硝酸銀離子還原成銀顆粒，在抗原抗體復(fù)合物上形成黑色“銀殼”，使Ag位置放大，從而提高了鏡下的可見(jiàn)度。

目前七十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)用NC膜或微孔濾膜為載體吸附抗原，用膠體金標(biāo)記抗體代替酶標(biāo)抗體。2、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（DICA）目前七十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)六、免疫印跡技術(shù)（immunoblotting）

又稱(chēng)為Western-blotting，是將凝膠電泳的高分辨力與固相免疫測(cè)定結(jié)合起來(lái)的一種方法。由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印和固相膜免疫測(cè)定三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成。目前七十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）

是將免疫學(xué)反應(yīng)和PCR技術(shù)相結(jié)合而創(chuàng)建的一種新的檢測(cè)技術(shù)，具有抗原、抗體反應(yīng)的特異性和PCR技術(shù)的高效性。基本原理：用一段已知的DNA分子作為標(biāo)記物，結(jié)合一抗或二抗后去檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體，再用PCR法擴(kuò)增該DNA分子，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳定性，根據(jù)該DNA分子的存在與否，確定檢測(cè)結(jié)果。該方法與ELISA的原理類(lèi)似，不同的是以DNA分子作為標(biāo)記物。免疫PCR可采用直接法、間接法和雙抗體夾心法。目前七十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前七十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)八、細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)（一）形態(tài)學(xué)檢測(cè)

①應(yīng)用電子顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡直接觀察細(xì)胞大小、凋亡小體和其他凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；②應(yīng)用某些可直接、間接產(chǎn)生熒光的染料[如雙苯并咪唑（HO）、碘化丙啶（PI）、AnnexinV等]使細(xì)胞著染，借助熒光顯微鏡區(qū)分凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和正常細(xì)胞。目前七十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）生物化學(xué)檢測(cè)方法

凋亡細(xì)胞染色質(zhì)DNA在核小體單位間連接處斷裂，形成180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。（三）免疫學(xué)檢測(cè)方法

原理：凋亡細(xì)胞染色質(zhì)DNA斷裂而產(chǎn)生的核小體DNA，可與組蛋白結(jié)合為復(fù)合物。應(yīng)用抗組蛋白和抗DNA單抗，借助ELISA方法可測(cè)定細(xì)胞凋亡。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是：①可用于檢測(cè)不同培養(yǎng)細(xì)胞株或不同動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞凋亡；②靈敏度高，且可檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。目前七十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（四）分子生物學(xué)檢測(cè)方法

常用技術(shù)為脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL），原理：凋亡細(xì)胞的DNA鏈發(fā)生斷裂而暴露3’-OH末端，可借助末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）將脫氧核糖核酸與熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA3’-OH末端，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡。TUNEL法的優(yōu)點(diǎn)是：能對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或凋亡小體進(jìn)行原位染色；適用于不同樣本的檢測(cè)；靈敏度遠(yuǎn)比一般組織化學(xué)和生化測(cè)定法高。目前七十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前七十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（五）流式細(xì)胞術(shù)1、亞“G1”峰檢測(cè)法

處于增殖周期的細(xì)胞，其在不同周期時(shí)相（Go/G1、S、G2/M）的DNA含量為2n~4n。凋亡細(xì)胞核內(nèi)的DNA裂解成小片段，應(yīng)用胞膜通透劑可使小分子量DNA片段穿過(guò)胞膜而丟失，僅剩大片段DNA，這些失去部分DNA的細(xì)胞，染色后形成一個(gè)DNA含量＜2n（即＜G1期細(xì)胞）的分布區(qū)，稱(chēng)為“亞G1峰”。該技術(shù)的缺點(diǎn)為：不能反映發(fā)生于G1峰后S期和G2期的細(xì)胞凋亡；不能區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞。目前七十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2、HO/PI染色法

原理：HO被活細(xì)胞攝取，與DNA結(jié)合后在紫外光下呈藍(lán)色熒光；PI使死細(xì)胞著染，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)兩種熒光所形成的細(xì)胞二維直方圖，可分辨正?；罴?xì)胞、凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞。3、Annexin法

應(yīng)用AnnexinV，AnnexinV是一種Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類(lèi)如PS（磷脂酰絲氨酸）的特性。對(duì)PS有高度的親和性。借助FCM可定量分析被標(biāo)記的凋亡與壞死細(xì)胞數(shù)。目前八十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)4、caspase活性檢測(cè)

caspase（胱天蛋白酶）水平及活性升高乃細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，并反映效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。應(yīng)用能透過(guò)胞膜的caspase熒光底物，其被酶切后釋放熒光基團(tuán)，借助FCM檢測(cè)所釋放的熒光強(qiáng)度，可推斷caspase活性。該法優(yōu)點(diǎn)為：可在單細(xì)胞水平對(duì)抗原特異性T細(xì)胞細(xì)胞毒作用進(jìn)行可視化和數(shù)量化分析。目前八十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)第二節(jié)

免疫分子的檢測(cè)目前八十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)一、免疫球蛋白測(cè)定檢測(cè)IgG、IgA、IgM含量常用單向免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法以及免疫化學(xué)自動(dòng)分析儀。血清中IgE和IgD含量很低，須用RIA、ELISA、RAST等靈敏度較高的方法測(cè)定。目前八十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)二、補(bǔ)體測(cè)定（一）血清總補(bǔ)體活性測(cè)定原理：應(yīng)用家兔抗SRBC抗體致敏的SRBC作為抗原-抗體復(fù)合物，激活待測(cè)血清中補(bǔ)體經(jīng)典途徑，導(dǎo)致SRBC溶解；若待測(cè)血清樣品中補(bǔ)體含量減少或某種補(bǔ)體成分缺失，可影響此種溶血反應(yīng)。通常以50%溶血作為判定反應(yīng)結(jié)果的終點(diǎn)，故稱(chēng)為50%溶血試驗(yàn)（50%complementhemolysis，CH50）。根據(jù)引起50%溶血所需的最小補(bǔ)體量，計(jì)算血清總補(bǔ)體活性。目前八十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）血清補(bǔ)體旁路途徑活性測(cè)定原理：家兔紅細(xì)胞（RRBC）可直接激活人B因子，引起補(bǔ)體旁路途徑活化，導(dǎo)致RRBC溶解。（三）補(bǔ)體各成分測(cè)定1、免疫溶血法該法可用于C4、C2及B因子測(cè)定。以抗體致敏的SRBC作為指示系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。2、免疫化學(xué)法常用方法有單向免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法、ELISA及RIA等。目前八十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)三、細(xì)胞因子及其受體檢測(cè)（一）生物學(xué)檢測(cè)法原理為：根據(jù)CK特定的生物學(xué)活性，采用相應(yīng)指示系統(tǒng)（如各種依賴(lài)性細(xì)胞株或靶細(xì)胞），通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，判斷樣品中細(xì)胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示?？煞譃榇龠M(jìn)細(xì)胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、細(xì)胞毒活性測(cè)定法、細(xì)胞病變抑制法、趨化活性測(cè)定法等。目前八十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)生物學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（達(dá)pg水平），并能直接顯示CK生物活性。生物學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn)：多種CK可能具有相同功能，故干擾因素較多；某些抑制因子可降低CK活性；某些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CK受體，其與CK結(jié)合將影響生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果。目前八十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）免疫學(xué)檢測(cè)法1、體液中CK的檢測(cè)幾乎所有CK均可借助免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。常用方法包括ELISA（雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法）、RIA及免疫印跡法等。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品（如腦脊液）可用免疫PCR（immuno-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，極大地提高檢測(cè)靈敏度（可達(dá)1012mol/L）。目前八十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

2、單個(gè)細(xì)胞分泌CK的檢測(cè)（1）反向溶血空斑試驗(yàn)（reversedhemolyticplaqueassay，RHPA）RHPA是一種體外檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞的試驗(yàn)。亦可將其用于測(cè)定CK分泌細(xì)胞。原理：待測(cè)CK分泌細(xì)胞+抗CK抗體+SPA-SRBC+補(bǔ)體，4種成分與瓊脂糖凝膠混勻，注入小室內(nèi)；反應(yīng)后導(dǎo)致SRBC溶解，在CK分泌細(xì)胞周?chē)纬扇苎瞻?，每個(gè)空斑代表一個(gè)CK分泌細(xì)胞，空斑大小與細(xì)胞所分泌CK的量成正比。目前八十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

（2）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）

原理：抗CK抗體包被固相載體+待測(cè)分泌CK的細(xì)胞+結(jié)合后洗去細(xì)胞+酶標(biāo)抗CK抗體+底物，顯色反應(yīng)的深淺測(cè)定結(jié)合在固相載體上的CK量，并可在光鏡下觀察分泌CK的細(xì)胞。目前九十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前九十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3、細(xì)胞內(nèi)CK的檢測(cè)采用FCM免疫熒光技術(shù)可從單細(xì)胞水平檢測(cè)不同細(xì)胞亞群中的CK，用不同顏色熒光標(biāo)記的抗CK抗體可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)測(cè)定兩種不同CK。目前九十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)免疫學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：①特異性強(qiáng)，可測(cè)出單一細(xì)胞因子含量；②方法簡(jiǎn)便，無(wú)須細(xì)胞培養(yǎng)，便于大量樣品檢測(cè)；③實(shí)驗(yàn)流程短，方法易標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好免疫學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn)：①免疫學(xué)方法所檢出的細(xì)胞因子含量，與該因子生物活性并非必然平行；②不同單抗所識(shí)別的細(xì)胞因子表位和親和力不同，所測(cè)結(jié)果可出現(xiàn)差異。目前九十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）分子生物學(xué)檢測(cè)法應(yīng)用細(xì)胞因子cDNA探針或寡核苷酸探針，經(jīng)放射性核素（32P或35P）、生物素或地高辛標(biāo)記，與提取的細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行雜交（Northernblot）；亦可在細(xì)胞或組織切片上進(jìn)行原位雜交分析；若同時(shí)結(jié)合免疫組化技術(shù)，還可鑒定表達(dá)細(xì)胞因子基因的細(xì)胞類(lèi)型。目前九十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)分子生物學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：特異性高。分子生物學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn)：僅能檢測(cè)CK基因表達(dá)情況，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表達(dá)與調(diào)控。目前九十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)四、黏附分子的檢測(cè)（一）細(xì)胞膜表面AM檢測(cè)1、間接免疫熒光法——組織細(xì)胞表面AM組織切片標(biāo)本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG熒光抗體，進(jìn)行間接免疫熒光染色，借助熒光顯微鏡觀察表達(dá)AM的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。2、間接酶免疫組化法——組織細(xì)胞表面AM組織切片標(biāo)本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，加入酶底物顯色，顯微鏡觀察表達(dá)AM的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。3、流式細(xì)胞術(shù)——內(nèi)皮、淋巴細(xì)胞等表面AM待檢細(xì)胞懸液+兩種熒光素標(biāo)記單抗，在流式細(xì)胞儀上可同時(shí)檢測(cè)胞膜表面兩種不同的AM。目前九十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）可溶性AM測(cè)定1、ELISA雙抗體夾心：最常用于檢測(cè)選擇素家族和免疫球蛋白超家族成員。2、其他免疫測(cè)定方法：RIA或IRMA、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法等目前九十七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)第三節(jié)

免疫細(xì)胞的檢測(cè)一、免疫細(xì)胞的分離與純化（一）白細(xì)胞的分離1、自然沉降法2、高分子聚合物加速沉降法目前九十八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F(xiàn)-H）密度梯度離心法2、Percoll密度梯度離心法

（連續(xù)和不連續(xù)）目前九十九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）淋巴細(xì)胞的純化與亞群分離1、去除紅細(xì)胞一般采用無(wú)菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。

2、去除血小板離心洗滌或胎牛血清（FCS）梯度離心法，因FCS可讓單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)，而阻止血小板通過(guò)。目前一百頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3、去除單核細(xì)胞和粒細(xì)胞（1）黏附法玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱，清除發(fā)生黏附的細(xì)胞（2）羰基鐵粉吞噬法單核細(xì)胞吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底（3）苯丙氨酸甲酯法苯丙氨酸甲酯具有親溶酶體性質(zhì)，用該法可溶解含溶酶體的細(xì)胞（如單核、粒細(xì)胞等）。

目前一百零一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

4、淋巴細(xì)胞亞群的分離

（1）E花環(huán)分離法T細(xì)胞表達(dá)SRBC受體，能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)，而B(niǎo)細(xì)胞則不能。經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心，可將T、B細(xì)胞分離。（2）尼龍棉柱分離法B細(xì)胞易黏附于尼龍棉纖維（聚酰胺纖維）表面，而T細(xì)胞則不易黏附，借此可將T細(xì)胞與B細(xì)胞分離。目前一百零二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（3）親和板結(jié)合分離法（洗淘法）直接結(jié)合法：抗體包被塑料平皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）+細(xì)胞，吸附表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。間接結(jié)合法：包被抗小鼠IgG抗體（第二抗體）+與單抗結(jié)合的淋巴細(xì)胞，被吸附固定而分離。特異性抗原（配體）包被+表達(dá)相應(yīng)受體的細(xì)胞，該細(xì)胞被分離。目前一百零三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的陽(yáng)性分選和陰性分選，且所獲細(xì)胞量較大。缺點(diǎn)：親和板結(jié)合分離法一般適合進(jìn)行陰性分選。此外，包被的抗體宜采用不含F(xiàn)c段的（Fab’）2抗體片段，以免發(fā)生非特異性吸附。目前一百零四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（4）補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法抗體+細(xì)胞+補(bǔ)體，通過(guò)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用（CDC）而清除相應(yīng)細(xì)胞，用于細(xì)胞陰性分選。

（5）流式細(xì)胞術(shù)分選法目前一百零五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)直接法：將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，稱(chēng)為免疫磁珠（IMB），其可與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合；應(yīng)用強(qiáng)磁場(chǎng)分離IMB及其所吸附細(xì)胞，從而對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行陰性或陽(yáng)性分選。間接法：用抗小鼠IgG抗體（第二抗體）包被磁性微珠，可與任何已結(jié)合鼠源性單克隆抗體（一抗）的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。（6）磁性激活細(xì)胞分離器（MACS）分離法

目前一百零六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)MACS分離法優(yōu)點(diǎn)：所獲細(xì)胞純度高（93%~99%），獲率可達(dá)90%，活細(xì)胞率＞95%；分離效果可與流式細(xì)胞術(shù)相媲美，但比后者省時(shí)且費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：陽(yáng)性分選中，抗體可導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞凋亡。目前一百零七頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（四）單核-吞噬細(xì)胞分離和收集1、將PBMC通過(guò)Percoll連續(xù)密度梯度離心法或洗淘法（陽(yáng)性分選）可獲取單核細(xì)胞，但所得細(xì)胞數(shù)量較少。2、斑蝥敷貼法可以從組織滲出液中獲得數(shù)量較多且較純的巨噬細(xì)胞，亦無(wú)需作進(jìn)一步分離。3、以滅菌巰基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基（或無(wú)菌液體石蠟）注入小鼠腹腔內(nèi)，引起無(wú)菌性炎性滲出，從腹腔沖洗液中可獲得大量巨噬細(xì)胞（＞85%）。目前一百零八頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)二、淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)（一）T細(xì)胞檢測(cè)計(jì)數(shù)1、間接免疫熒光法

應(yīng)用抗CD3/CD4/CD8單抗與PBMC結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（第二抗體），在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。2、酶免疫組化法1）堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（APAAP）法；2）ABC法（間接法）

細(xì)胞涂片+單抗+二抗-B+AB*C+底物顯色3、流式細(xì)胞術(shù)采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)4、免疫金銀染色法（IGSS）目前一百零九頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）B細(xì)胞檢測(cè)計(jì)數(shù)1、膜表面免疫球蛋白（mlg）檢測(cè)

細(xì)胞涂片+熒光素標(biāo)記抗Ig抗體（免疫熒光法）/+酶標(biāo)記抗Ig抗體（酶免疫組化法）2、間接免疫熒光法

細(xì)胞+CD19/CD20/CD21/CD22等的單抗+熒光素標(biāo)記的二抗，鑒定和檢測(cè)計(jì)數(shù)B細(xì)胞。3、流式細(xì)胞術(shù)4、B細(xì)胞亞群檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀，標(biāo)記CD5單抗和標(biāo)記CD19單抗，鑒定B1細(xì)胞和B2細(xì)胞。目前一百一十頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)三、免疫細(xì)胞功能測(cè)定（一）吞噬細(xì)胞功能測(cè)定1、中性粒細(xì)胞趨化功能測(cè)定（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）

在上室加入待測(cè)細(xì)胞，下室加入趨化成分，上下室間被具有一定孔徑和厚度的纖維膜隔開(kāi)，反應(yīng)后取纖維膜清洗后進(jìn)行固定、染色和透明化，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越纖維膜的移動(dòng)距離，從而判斷其趨化作用。目前一百一十一頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（2）瓊脂糖平板法：在瓊脂糖平板中央孔內(nèi)加白細(xì)胞懸液，兩側(cè)孔內(nèi)分別加趨化因子或?qū)φ找?，反?yīng)后通過(guò)固定和染色，觀察細(xì)胞定向移動(dòng)能力。目前一百一十二頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2、中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測(cè)定（1）顯微鏡檢法

白細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合、溫育，取樣制片、固定、染色；在油鏡下觀察多形核白細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬情況，計(jì)算其吞噬率（%）和吞噬指數(shù)（phagocyticindex）及殺菌率。目前一百一十三頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（2）硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)中性粒細(xì)胞在吞噬、殺菌過(guò)程中，能量消耗驟增，氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代謝活性增強(qiáng)；葡萄糖分解的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖在氧化脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯沁^(guò)程中，所釋放的氫被攝入吞噬體的NBT染料接受，使其被還原成藍(lán)黑色點(diǎn)狀或塊狀甲臢顆粒，沉積于中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。一般以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)10%判定為NBT試驗(yàn)陽(yáng)性。

目前一百一十四頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)3、巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定

巨噬細(xì)胞+雞紅細(xì)胞（具有清晰可見(jiàn)的胞核）吞噬試驗(yàn)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。4、巨噬細(xì)胞胞毒作用測(cè)定用-干擾素激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察其對(duì)125I-UdR標(biāo)記的小鼠肥大細(xì)胞瘤P815的殺傷活性。

目前一百一十五頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）T細(xì)胞功能測(cè)定1、T細(xì)胞增殖（轉(zhuǎn)化）試驗(yàn)

T細(xì)胞在體外受抗原或絲裂原（PHA、ConA）刺激后，細(xì)胞代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，并轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞。（1）形態(tài)學(xué)觀察：依據(jù)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)特征，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：方法較簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，準(zhǔn)確性較差。目前一百一十六頁(yè)\總數(shù)一百二十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）摻入法：

T細(xì)胞增殖，其胞內(nèi)新合成DNA需攝取核苷酸原料，故應(yīng)用核素標(biāo)記的核苷酸參與反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度可反映淋巴細(xì)胞增殖水平。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，可自動(dòng)操作。缺點(diǎn)：若操作不規(guī)范，可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性，另存在放射性核素污染危險(xiǎn)