基因工程的基本操作程序課件【知識 精講精研 】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

從社會中來普通棉花將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花我國是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉從社會中來培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程蘇云金桿菌

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因第三章基因工程

第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W習(xí)目標(biāo)闡明基因工程的原理和基本操作程序。（生命觀念、科學(xué)思維）0102針對人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。（科學(xué)思維、科學(xué)探究）03嘗試進(jìn)行PCR的基本操作，并用電泳鑒定PCR產(chǎn)物。（科學(xué)思維、科學(xué)探究）基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段DNA片段基因1基因2基因3放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段——原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子連續(xù)的、不間隔的RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因上游終止子本質(zhì)：位置：作用：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因下游終止轉(zhuǎn)錄基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段——真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子間隔的、不連續(xù)的內(nèi)含子外顯子外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列?；蛲ǔＪ怯羞z傳效應(yīng)的DNA片段——真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)啟動子終止子內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄初級RNA成熟mRNA剪切、拼接基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點都有能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼非編碼序列=非編碼區(qū)原核基因：非編碼序列真核基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子目的基因的篩選與獲取一一、目的基因在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。目的基因的篩選與獲取一蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。目的基因的篩選與獲取一二、篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。測序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)序列比對工具(如BLAST)測定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內(nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。目的基因的篩選與獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes三、目的基因的獲取方法3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1.從基因文庫中獲取2.通過DNA合成儀直接合成從基因文庫中直接獲?、倩蛭膸斓臉?gòu)建過程

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。目的基因的篩選與獲取——從基因文庫中直接獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes——Directlyfromthegenelibrary②基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段該生物基因組文庫每個受體菌含有一段不同的DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。目的基因的篩選與獲取——從基因文庫中直接獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes——Directlyfromthegenelibrary含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA(cDNA)該生物cDNA文庫基因組文庫中的基因含有啟動子、終止子、內(nèi)含子，cDNA文庫中的基因不含以上結(jié)構(gòu)。與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶某一發(fā)育時期基因組文庫從細(xì)胞中提取DNA細(xì)胞基因組DNA質(zhì)粒質(zhì)粒酶切DNA連接酶連接限制酶酶切導(dǎo)入細(xì)菌中基因組文庫克隆提取酶切的DNA片段cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶切的cDNA片段限制酶酶切質(zhì)粒質(zhì)粒酶切連接導(dǎo)入細(xì)菌中cDNA文庫克隆提取目的基因的篩選與獲取——從基因文庫中直接獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes——Directlyfromthegenelibrary文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以目的基因的篩選與獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes通過DNA合成儀直接合成（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因目的基因的篩選與獲取——通過DNA合成儀直接合成Screeningandacquisitionoftargetgenes——DirectlysynthesizedbyDNAsynthesizer目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成目的基因的篩選與獲取——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一三、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一項根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與

，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的篩選與獲取——體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件一參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸目的基因的篩選與獲取——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′端子鏈合成需要引物:引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)目的基因的篩選與獲取——引物一引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。什么是引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵。-5′3′-引物15

′--3′5′--3′引物23′--5′目的基因的篩選與獲取——體外PCR所需的基本條件一耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP目的基因的篩選與獲取一dATP

腺嘌呤脫氧核苷酸dADP腺苷（A)

腺嘌呤脫氧核糖PPP~~OHH在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。目的基因的篩選與獲取——體外PCR所需的基本條件一參與的組分在PCR的作用目的基因DNA4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)引物緩沖液Mg2+高溫使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈維持反應(yīng)體系的pH激活DNA聚合酶的活性目的基因的篩選與獲取——PCR過程一DNA解鏈為單鏈高溫(超過90℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過程可以在PCR擴(kuò)增(PCR儀)中自動完成。目的基因的篩選與獲取——PCR過程一第1步：變性5

′-3

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′當(dāng)溫度超過90℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈。95℃目的基因的篩選與獲取——PCR過程一5

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′-5

′3

′-第2步：復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。50℃長度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高思考復(fù)性時引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會。復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？目的基因的篩選與獲取——PCR過程一5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

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′-5

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′3

′-當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。72℃目的基因的篩選與獲取——PCR過程一第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′目的基因的篩選與獲取——PCR過程一第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’思考思考:用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶RNA鏈

DNA鏈

目的基因的篩選與獲取一常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。較小的DNA片段在凝膠中的移動相對容易，較大的DNA片段移動難。當(dāng)電泳結(jié)束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標(biāo)準(zhǔn))，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation長鏈-中長鏈DNA____個含有引物A的DNA____個含有引物B的DNA____個211第一次擴(kuò)增引物A引物B拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation中長鏈-短鏈DNA____個2長鏈-中長鏈DNA____個含有引物A的DNA____個含有引物B的DNA____個233第二次擴(kuò)增拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation第三次擴(kuò)增中長鏈-短鏈DNA____個4長鏈-中長鏈DNA____個含有引物A的DNA____個含有引物B的DNA____個277短鏈-短鏈DNA______個2拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation第四次擴(kuò)增中長鏈-短鏈DNA____個6長鏈-中長鏈DNA____個含有引物A的DNA____個含有引物B的DNA____個21515短鏈-短鏈DNA______個8拓展應(yīng)用——PCR擴(kuò)增DNA規(guī)律Theirapplication——RuleofPCRamplificationofDNA擴(kuò)增次數(shù)第1次第2次第3次第4次第n次DNA總數(shù)212223242n長鏈-中長鏈DNA中長鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A(或B)的DNA20022240226822(n-1)2n-2n137152n-1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——過程歸納Polymerasechainreaction——Theprocessofinduction一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴(kuò)增n次：①子代DNA分子數(shù)為：___個②子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__個③子代含有的目的基因數(shù)目：_____個④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個⑤復(fù)制過程中共需引物_______個⑥第n次復(fù)制需要引物___個2n22n-12n＋1-22n2n-2nPCR擴(kuò)增DNA規(guī)律拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下就可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如下圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第⑤種DNA分子有()A.8個B.6個C.4個D.2個A拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation圖中引物中為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為________。15/162.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基本因，

其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)應(yīng)用Theirapplication——PCRrelatedapplication擴(kuò)增目的基因檢測目的基因產(chǎn)生突變基因用模板DNA和目的基因相關(guān)引物擴(kuò)增用待測DNA和目的相關(guān)引物擴(kuò)增有擴(kuò)增產(chǎn)物則含有目的基因無擴(kuò)增產(chǎn)物則不含目的基因可在引物中或引物的5`端引入突變序列產(chǎn)生大量目的基因產(chǎn)生大量突變基因PCR的應(yīng)用拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)應(yīng)用Theirapplication——PCRrelatedapplicationSRY—PCR是對移植前的胚胎進(jìn)行性別鑒定的技術(shù)。以Y染色體上SRY基因（性別決定基因）的一段序列作引物，用被測胚胎DNA作_____進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)SRY基因序列設(shè)計的引物長度一般為20～24個核苷酸，其不宜過短的原因主要是__________________。兩種引物中G＋C的含量相差不宜過大，原因主要是________________________________。防止引物隨機(jī)結(jié)合C、G含量差別大，低溫復(fù)性難統(tǒng)一模板拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers設(shè)計的目的是在兩個目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增高效性。1.引物設(shè)計需考慮的兩個因素擴(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物特異性：只擴(kuò)增出目標(biāo)DNA的特性高效性：單位時間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量特異性太強(qiáng)，擴(kuò)增效率就會下降提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增特異性就會下降拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers2.引物設(shè)計的原則①引物長度一般在15-30堿基之間。過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq酶進(jìn)行反應(yīng)。過短特異性差。②引物G-C含量一般在40%~60%之間，G-C含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間配對結(jié)合，從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers④復(fù)性溫度復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高復(fù)性溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低復(fù)性溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的復(fù)性溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的復(fù)性溫度是一樣的。拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers⑤引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點，加標(biāo)記熒光，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。拓展應(yīng)用——PCR引物的設(shè)計Theirapplication——DesignofPCRprimers①引物長度要適宜②引物G-C含量要適宜③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列④引物5'端可以修飾，3'端不可修飾⑤復(fù)性溫度要適宜設(shè)計的目的是在兩個目標(biāo)間取得平衡:擴(kuò)增特異性和高效性。基因表達(dá)載體的構(gòu)建二獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？不是，游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。1.基因表達(dá)載體的作用①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在且遺傳給下一代;②使目的基因在受體細(xì)胞中能夠表達(dá)且發(fā)揮作用?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建二質(zhì)粒2.基因表達(dá)載體的組成標(biāo)記基因復(fù)制原點啟動子終止子限制酶切位點位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的作用。位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。供目的基因插入載體中便于重組DNA的篩選能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上基因表達(dá)載體與基因克隆載體Geneexpressionvectorandgenecloningvector基因克隆載體必須具備的條件標(biāo)記基因復(fù)制原點啟動子終止子限制酶切位點基因表達(dá)載體必須具備的條件基因表達(dá)載體插入的目的基因中必須含有能轉(zhuǎn)錄出完整的起始密碼子、終止密碼子和核糖體結(jié)合位點的序列?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建——注意事項二(1)基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了

。

目的基因(2)目的基因插入位點不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

。啟動子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動子：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——注意事項Constructionofgeneexpressionvector——Mattersneedingattention基因表達(dá)載體中啟動子、終止子的來源：①如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，已含有啟動子、終止子，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，不需要在質(zhì)粒上接上特定的啟動子、終止子。②如果目的基因是通過人工方法合成的，或是cDNA，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。基因表達(dá)載體的構(gòu)建二同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割DNA連接酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶切割位點質(zhì)粒重組DNA分子限制酶限制酶思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion用同一種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶分別切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段重組質(zhì)粒abcda、b、c、d四個黏性末端相同。限制酶切割DNA連接酶連接啟動子方向目的基因轉(zhuǎn)錄方向思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion缺點1：在DNA連接酶的作用下，質(zhì)粒自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion缺點2：在DNA連接酶的作用，目的基因自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestionabcd限制酶切割DNA連接酶連接反向連接重組DNA缺點3：在DNA連接酶的作用，目的基因與質(zhì)粒反向連接，造成目的基因不能正確表達(dá)。思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestionabcd限制酶切割DNA連接酶連接缺點1缺點2缺點3反向連接重組DNA質(zhì)粒自身環(huán)化目的基因自身環(huán)化思考分析——雙酶切Thinkinganalysis——Doubleenzyme用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段重組質(zhì)粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd黏性末端a與相同；黏性末端b與d相同。思考分析——雙酶切Thinkinganalysis——Doubleenzyme限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd質(zhì)粒不會重新環(huán)化目的基因不會被環(huán)化優(yōu)點1優(yōu)點2優(yōu)點3目的基因與質(zhì)粒不會發(fā)生反向連接確保目的基因與運(yùn)載體定向連接，減少重組雜物。思考·討論用限制酶切割時需注意的事項(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了

。但是使用該法缺點是容易發(fā)生

以及

，為避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質(zhì)粒反向連接目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體(2)獲取一個目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個游離的磷酸基團(tuán)。兩4(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：①切割目的基因時：

。②切割質(zhì)粒時：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選基因表達(dá)載體的構(gòu)建二限制酶限制酶DNA連接酶質(zhì)粒重組DNA分子目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。方法植物細(xì)胞：動物細(xì)胞：微生物細(xì)胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)由于受體細(xì)胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會有差別。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞三1.花粉管通道法我國科學(xué)家獨創(chuàng)的一種方法。①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②可以在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——花粉管通道法三優(yōu)點①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進(jìn)入胚囊，此時的受精卵未形成細(xì)胞壁，且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡單、技術(shù)成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導(dǎo)再生植株的全套人工培養(yǎng)過程。受體細(xì)胞：受精卵將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞三2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法采用最多①農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②當(dāng)植物體受到損傷時，傷口處的細(xì)胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)

轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞的DNA上。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持____和____的過程。受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受體細(xì)胞為_______體細(xì)胞受體細(xì)胞為_______受精卵①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Introducethetargetgeneintotherecipientcell——Agrobacteriumtransformationmethod②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三

__________插入Ti質(zhì)粒的________中形成重組Ti質(zhì)粒重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入_______轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞目的基因插入植物細(xì)胞中的____________上目的基因在植物細(xì)胞中穩(wěn)定存在并_____表達(dá)目的基因T-DNA農(nóng)桿菌染色體DNA將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三①兩次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。②兩次導(dǎo)入第一次導(dǎo)入：將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞三3.基因槍法適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——動物細(xì)胞三顯微注射法受精卵注射器固定吸管將含有目的基因的表達(dá)裁體提純→顯微注射入動物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物受體細(xì)胞：受精卵將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——動物細(xì)胞Introducethetargetgeneintotherecipientcell——Animalcells拓展：科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——動物細(xì)胞Introducethetargetgeneintotherecipientcell——Animalcells腺病毒載體新冠疫苗的制備將編碼新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因組中，接種后，隨載體增殖，大量所需的抗原得以表達(dá)。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞三1.原核生物的作為受體細(xì)胞的優(yōu)點①繁殖快②單細(xì)胞③遺傳物質(zhì)少2.導(dǎo)入方法：Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞三胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工用原核生物生產(chǎn)胰島素示意圖注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子目的基因的檢測與鑒定——分子水平的檢測四檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。1.分子水平的檢測①檢測目的基因是否導(dǎo)入方法1：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板是否擴(kuò)增出目的基因PCR操作電泳操作非轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉陰性對照Marker目的基因的檢測與鑒定——DNA分子雜交技術(shù)四方法2：DNA分子雜交技術(shù)堿基互補(bǔ)配對原理：酶切轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補(bǔ)配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。目的基因的檢測與鑒定——DNA分子雜交技術(shù)四①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA。②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素（熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑）等作標(biāo)記,以此做探針。③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。基因探針：一段帶放射性標(biāo)記的、與目的基因互補(bǔ)的特異核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA，探針的長度可以包括整個基因，或基因的一部分。目的基因的檢測與鑒定——分子水平的檢測四提取RNA轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針RNA②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄方法1：RT-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取RNARNA作為模板PCR操作電泳是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA方法2：DNA分子雜交技術(shù)RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖目的基因的檢測與鑒定——分子水平的檢測四③檢測目的基因是否翻譯方法：抗原—抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物放射性檢測

（雜交帶）過程：提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)抗體→是否出現(xiàn)雜交帶目的基因的檢測與鑒定——個體水平的檢測四2.個體水平的檢測檢測目的基因是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀方法：抗蟲鑒定、抗病鑒定等棉鈴蟲棉鈴蟲（死亡）目的基因的檢測與鑒定四類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等目的基因的檢測與鑒定四總結(jié)目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵花粉管通道法(植物)、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。到社會中去1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動子、提高殺蟲基因的表達(dá)量等。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評價等。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五實驗原理（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：（2）PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments2.DNA片段電泳鑒定的原理：

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

在電泳開始時使用低壓有利于條帶清晰，是因為點樣之后樣品內(nèi)分子是胡亂排列的，加上電壓之后才統(tǒng)一方向排列好。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。

注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象

。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

電泳緩沖液類似色素提取的層析液，點樣孔通常位于電極的負(fù)極端，由于DNA分子在緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場中DNA便向正極端移動，從而分離出大小不同的DNA片段。

DNA電泳一定要使用DNA

Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。

凝膠中的DNA分子通過染色，在波長為300nm的紫外燈下才能被檢測出來。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五1.試劑：（1）無菌水、瓊脂糖；（2）電泳緩沖液（TAE或TBE）；（3）凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。2.用具：（1）PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）（2）微量離心管（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）（3）微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）（4）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）（5）電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五推動桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭微量離心管PCR儀注意：加不同樣品時，需要更換槍頭電泳裝置DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。1.PCR加樣材料用量10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μLDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五2.離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。3.擴(kuò)增將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s