分子生物學(xué)基本技術(shù) -CR olymerase Chain Reacion

分子生物學(xué)基本技術(shù)—PCR

(PolymeraseChainReaction)PCR(PolymeraseChainReaction)一、歷史及其發(fā)展二、PCR的基本原理三、Primerdesign引物常規(guī)設(shè)計原則四、PCR反應(yīng)體系五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（PCRoptimization)六、PCR反應(yīng)特點七、PCR產(chǎn)物的分析八、Molecularmarker九、PCR技術(shù)的應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)體系基本技術(shù)基因及產(chǎn)物分子檢測技術(shù)基因及產(chǎn)物獲取技術(shù)基因功能研究技術(shù)

基本技術(shù)

1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS電泳

3.PCR技術(shù)

4.細(xì)菌轉(zhuǎn)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR(PolymeraseChainReaction)一、歷史及其發(fā)展：1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。1993年：Mullis與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”加拿大籍英國科學(xué)家MichaelSmith共獲諾貝爾化學(xué)獎KaryMullis&MichaelSmith

穆利斯（KaryMullis）美國化學(xué)家1944～史密斯（MichaelSmith）加拿大化學(xué)家1932～

二、PCR的基本原理?PCR的基本原理：變性、復(fù)性、半保留復(fù)制?PCR三步曲Threesteps：

Denaturation

變性90～97℃

Primerannealing

退火45～55℃

Polymerization

延伸72℃原理

類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)?；貞洠篋NA的復(fù)制……

DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶回憶：DNA的復(fù)制……RNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’引物酶引物酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長回憶：DNA的復(fù)制……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶回憶：DNA的復(fù)制……PCR簡要過程圖解PCR詳細(xì)過程圖解1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95℃150℃引物1引物2DNA引物2引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶3第1輪結(jié)束95℃第2輪開始472℃TaqTaqTaqTaq5PCR的咐基本原理PCR盡反應(yīng)條全件PCR矮過程PCR媽的特點模板DN載A第1輪鐮擴增第2輪吹擴增第3輪沃?jǐn)U增第4輪企擴增第5輪丑擴增第6輪擴姿增三、Pri酸mer間de脊sig蚊n引物常規(guī)軍設(shè)計原則1.忙長度：奇15-堪37閉nt,穗一般脈20n凳t左右容;(美僅bi妙ndi床ng加,不總含接頭釋)2.串G+毒C挽含量4亭0％～柄60％秩，而且伍四種堿李基的分垂布最好駁隨機。3.愁避免聚淺嘌呤或倘聚嘧啶尤或有回蹲文對稱斑結(jié)構(gòu)；4.偏引物自暫身不能誘互補（亂<3個辛）5.即引物之儉間不能趕互補（運<5恢個）6.引銷物３端不益能錯配,尸不能修煉飾，盡量噸不用T,初不能超豬過３個連繩續(xù)的G或罷C；7.掘５端可真變化修非飾，附郵加酶切搶位點；8.兩中引物的T訂m值應(yīng)比捕較接近；9.正應(yīng)鏈引物：慣mRNA搏序列照抄榜；負(fù)鏈引榨物：先抽寫出m昂RNA昨序列的澡互補序運列，然柴后翻轉(zhuǎn)脅重寫。10．珠解鏈溫測度Tm=忌4(邪G+C)小+2認(rèn)(A+T堡)粉[數(shù)=<20翻nt個]Tm振=8優(yōu)1.5賢+0棕.41秘*(G喊C%)考-60哨0/L就[>孤20真nt]Tm一般夾５５℃～陵８０℃椅［５西５℃～５敘８℃最佳撒］PCR待反應(yīng)中扔結(jié)合溫示度（a稿nne而ani蹦ng觀tem巷per蛾atu攪re）晉T=傭Tm這-睡5℃P+、P就-的設(shè)計鏡方法四、PC航R反應(yīng)體雜系標(biāo)準(zhǔn)的P謹(jǐn)CR反應(yīng)掃體系：10×度擴增緩這沖液到1粥0ul號4種帽dNT啟P混合荒物數(shù)各2努00u劈燕mol床/L磨引物吵各1厘0～1積00p草mol捐模橡板DN巖A平0鑼.1～平2ug蓮Taq痰DN惑A聚合浩酶調(diào)2.厲5u退Mg乳2+魯1.5昌mmo絕l/L偽加雙張或三蒸范水至葛1代00u賣lTemp戀late（模板猾）：ssD淺NA,精ds獅DNAmRNA革nee陶ded蓋tob榴eRT經(jīng)as版cDNA雄模板核酸帶的量與純握化程度，沉是PCR范成敗與否爹的關(guān)鍵環(huán)護(hù)節(jié)之一。Pri澤mes（引物）岸：每條引駁物的濃沈度0.更1～1鐵umo劣l或1柱0～1挽00p懶mol忠，以最述低引物犧量產(chǎn)生婚所需要對的結(jié)果傍為好，史引物濃腫度偏高臟會引起受錯配和食非特異酷性擴增酸，增加摔二聚體鐘的機會虹。純化旅引物在糧25％歉乙腈溶撥液中4曉℃；凍逮干引物棉于-2返0℃可桐保存1眉-2年廈，液體幻玉狀態(tài)于慘-20除℃可保賺存6個毯月。不悲用時應(yīng)參-20具℃保存劑。dNTP繼s：dNTP貼的質(zhì)量與尖濃度和P巴CR擴增體效率有密景切關(guān)系，屠多次凍融段會使dN委TP降解判。在PC宴R反應(yīng)中溫，dNT崖P應(yīng)為5淡0～20激0umo計l/L，弱尤其是注婦意4種d攻NTP的域濃度要相偶等(等團(tuán)摩爾配制才)，如其后中任何一癥種濃度不隱同于其它疾幾種時(怎偏高或偏董低)，就沾會引起錯檔配。濃度墊過低又會銹降低PC噸R產(chǎn)物的簽產(chǎn)量。d倆NTP能倉與Mg2雁+結(jié)合，暫使游離的乖Mg2+偽濃度降低構(gòu)。Mg2+：for寺Ta透qp毫oly端mer避ase除ac粒tiv家ityMg2眨+對P精CR擴蝕增的特對異性和疼產(chǎn)量有俯顯著的續(xù)影響，繭在一般蠟的PC嫁R反應(yīng)退中，各場種dN寸TP濃替度為2宣00u心mol陸/L時臟，Mg江2+濃所度為1串.5～旅2.0閥mmo尤l/L寸為宜。持Mg2將+濃度以過高，菜反應(yīng)特脖異性降模低，出里現(xiàn)非特粗異擴增春，濃度兼過低會繡降低T投aq奧DNA奮聚合酶鮮的活性辨，使反撫應(yīng)產(chǎn)物掙減少。Buff癢er：10-5保0mmo休l/L應(yīng)Tris能-HCl接(pH8粥.3-8耕.8,讀20℃)脂。Taq汁DN攪Ap塵oly駕mer托ase（T估aq啟DNA址聚合撲酶）：濃度過晌高可引拆起非特各異性擴呢增，濃婦度過低綁則合成沖產(chǎn)物量滔減少。分離:1969感年，美國筍黃石國家或公園溫泉分子量發(fā):94KD插a活性：在幾種水繭生棲熱菌蔥中活性最翅高，20他000萄0U/m結(jié)g離子需要胡：對Mg2柴+、單價組離子性質(zhì)般和濃度較糾敏感。最箱適濃度5翼0mmo諸l/L。忠實性:沒有校正廉單核苷酸艦錯配功能壩--致命肢弱點。一租般出錯率尖為2×1康0-4核枯苷酸/每伐輪循環(huán)，鋤利用PC段R克隆、你測序時尤遮應(yīng)注意。TaqDNA聚秘合酶酶活性(性%)40耕5泄0然6賢0盒70侍80秀9隊0恩10李010080604020五、PC各R反應(yīng)條島件優(yōu)化（PCR病op當(dāng)tim母iza歇tio愚n)1、變就性溫度燦和時間一般情遠(yuǎn)況下，喚92℃匆～95辨℃l亞-5m傷in足終以使模奔板DN理A變性腿，若低專于93只℃則需拌延長時丸間，但沒溫度不昆能過高狡，因為剛高溫環(huán)勉境對酶票的活性凍有影響閥。富含姐G和C病的序列酸，可適葬當(dāng)提高旺，但過響高或時溪間過長松都會導(dǎo)押致酶活落性損失姜。2、退火明(復(fù)性)我溫度與時塞間引物中議G、C仇含量高驅(qū)、長摔度長并雪與模板龍完全配疲對時，韻應(yīng)提高促溫度。亡溫度越甩高，產(chǎn)誦物特異遇性越高攏。通常繭37-靈55℃均、1-磁2分鐘疑。變性后溫雹度快速冷你卻至40懸℃～60訓(xùn)℃，可使孕引物和模裹板發(fā)生結(jié)真合。由于房誠模板DN姥A比引侮物復(fù)雜得扣多，引物連和模板之輪間的碰撞巧結(jié)合機會席遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綢模板互補迷鏈之間的火碰撞。?退火溫度科與時間，取決于引物的長貝度、堿基組成及其濃度，還有靶基序秧列的長抄度。引物況的復(fù)性姨溫度可雅通過以憑下公式旨幫助選換擇合適架的溫度間：Tm值(解鏈德溫度)=4(G碼+C)萌＋2(失A+T鍋)復(fù)性溫度=Tm犬值-(峽5～1挨0℃)3、延伸韻溫度和時買間?溫度：72℃拋，接近T祝aq酶的敵最適75請℃，高于厭90℃時借，DN球A合成幾茄乎不能進(jìn)卻行?Taq鞏DNA聚評合酶的生令物學(xué)活性：拜70勢～80薪℃1稿50核寫苷酸/競S/酶客分子獨7誦0℃掉60核此苷酸/朋S/酶焰分子爛5威5℃罵24核征苷酸/裙S/酶只分子?時間：過長俘會導(dǎo)致晃產(chǎn)物非漁特異性穩(wěn)增加。緒但對低牙濃度的養(yǎng)目的序儉列，則泳可適當(dāng)誤增加時著間。一飼般：1Kb晌以內(nèi)的柿DNA撕片段，你延伸時很間1m俘in是巷足夠猜的3～4宅kb的廚靶序列嶺需3～敬4mi換n10Kb敞需延伸至厭15mi易n。?延伸進(jìn)間誼過長會導(dǎo)桂致非特異咱性擴增帶僚的出現(xiàn)。訪對低濃度災(zāi)模板的擴單增，延伸以時間要稍豎長些。4、循竿環(huán)次數(shù)PCR衫循環(huán)次技數(shù)主要燭取決于參模板D菠NA的仁濃度。顆一般的乎循環(huán)次園數(shù)選在智30～紗40次蝕之間，解循環(huán)過挪多，非片特異性餃產(chǎn)物大歐量增加零，循環(huán)梅次數(shù)決徑定PC的R擴增致程度。六、P支CR反目應(yīng)特點1.特佛異性強課：①引物及與模板膜DNA翅特異正增確的結(jié)紹合；款②堿基毅配對原橋則；聚③Ta慘qD克NA聚蕩合酶合科成反應(yīng)膛的忠實襲性；竄④靶基遵因的特童異性與梨保守性堅。2.靈墨敏度高蚊：PCR產(chǎn)派物的生成末量以指數(shù)夸方式增加3.簡便顫、快速：PCR反您應(yīng)一般在昌2～4茂小時完成緣瑞擴增反應(yīng)完。擴增產(chǎn)盲物一般用涂電泳分析洗，不一定舊要用同位義素，無放奸射性污染期、易推廣。4.對標(biāo)擱本的純度盜要求低：DNA揭粗制品及播總RNA預(yù)均可作為帶擴增模板您?？芍苯勇视门R床標(biāo)切本如血液側(cè)、體腔液錢、洗嗽液僵、毛發(fā)、愈細(xì)胞、活漁組織等粗越制的DN示A擴增檢歇測。七、P糞CR產(chǎn)獎物的分扶析?1、凝槐膠電泳買分析通常應(yīng)用雄1～2%想的瓊脂糖漢凝膠，供撤檢測用。證聚河丙烯酰胺誰凝膠電泳鑒：6～1剪0%聚丙獨烯酰胺凝演膠電泳分拖離效果比貢瓊脂糖好宗，條帶比道較集中。?2、P釘CR產(chǎn)先物電泳EB溴辮乙錠染私色紫外瓦儀下觀松察，初器步判斷管產(chǎn)物的掩特異性望。目前假可用SYB季R的新型熒光染料來替代窯EB，鍛從而減洪少了對軌環(huán)境的撒污染，祥并可有桃效保護(hù)擺實驗操慨作者。?3、酶切籮分析根據(jù)PC輔R產(chǎn)物中巧限制性內(nèi)饒切酶的位潑點，用相春應(yīng)的酶切令、電泳分扎離后，獲悠得符合理活論的片段滲，此法既粗能進(jìn)行產(chǎn)皇物的鑒定熟，又能對虎靶基因分君型，還能泡進(jìn)行變異弊性研究。?4、分子桌雜交分子雜交炊是檢測P麥CR產(chǎn)物明特異性的吩有力證據(jù)啟，也是檢貸測PCR這產(chǎn)物堿劑基突變的杏有效方法思。在兩引物豆之間另合棋成一條寡牛核苷酸鏈誤(內(nèi)部寡獨核苷酸)六標(biāo)記后做錫探針，與猜PCR產(chǎn)揀物雜交。專此法既可縣作特異性群鑒定，又懼可以提高損檢測PC游R產(chǎn)物的皆靈敏度，銜還可知其諷分子量及氧條帶形狀聽。?5、核酸忘序列分析是檢測P功CR產(chǎn)物送特異性的均最可靠方熱法。八、Mo濫lecu掀lar槐mark久er1、傳州統(tǒng)水平：形態(tài)標(biāo)記季、細(xì)胞學(xué)曾標(biāo)記、生翁化標(biāo)記2、分隨子水平查：?第一類：電泳甩、分子慈雜交為倦核心代表：RFL霜P?第二類：電泳、待PCR為征核心代表：RAP畢D、SS蛙R、AF孤LP?第三類：DNA特序列為被核心代表：單堿基多伍態(tài)性（S牢NP），塵DNA序笨列的單個竹核苷酸的競差別3、應(yīng)用種質(zhì)資源兆研究品質(zhì)純蓄度鑒定能（包括障DNA斤指紋鑒醬定）構(gòu)建遺傳痕連鎖圖基因定位注（QTL路）標(biāo)記輔助傘選擇比較基暢因組研幅究基因克隆扣（圖位克可隆）生物起坐源、進(jìn)車化、醫(yī)塞學(xué)及法溜醫(yī)學(xué)（一）RFL熟P(Rest妖ric炕tio既nFrag腰men扁tLeng宿thPoly喘mor港phi疊sm)物種的基澇因組DN保A在限制腦性內(nèi)切酶血作用下，開產(chǎn)生相當(dāng)羨多的大小習(xí)不等的片姐段，用放爽射性同位綁素標(biāo)記的恒DNA作曠探針，把酷與被標(biāo)記禿DNA相岸關(guān)的片段端檢測出來蹤蝶，從而構(gòu)浮建出多態(tài)烈性圖譜。自從人您的RF近LP圖栗譜構(gòu)建糟后，又新分別構(gòu)飼建了果朋蠅、牛障、大豆田、小麥管、水稻幼等多種憑生物的環(huán)RFL牽P圖譜婚。優(yōu)點:共顯性，師非常穩(wěn)定缺點：檢測步惱驟多，玩周期長鞭，費時查、費錢紛；用臣作探針淺的DN趴A克隆航制備、鴨保存不管方便；刊放射性蜓同位素（二）RAPD（Rando勵mAmpli繁fiedPoly策mor辜phi抓smDNA)RAPD隨機多態(tài)奶性DNA枕擴增1、常規(guī)反PCR中控需要兩個聰引物，長恒度20-絡(luò)30個核簽苷酸。散RAPD編只需一個都引物，長譽度9-1它0個核苷大酸，而且福是隨機引蜂物。2、R既APD良引物短刪，因此蜻退火溫園度要低墓，一般捷為35鎮(zhèn)-37脾℃。3、桿RAP洗D易發(fā)斧現(xiàn)多態(tài)膊性，敏渾感性高更?？烧冶俪雠c靶獻(xiàn)基因連然鎖的R稼APD副標(biāo)記，明進(jìn)行基核因定位拔。（三）AFLP(Amp裕lifi能edR嫂estr睡icti搬onf供ragm秋ent裕pol休y