食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測(大豆)

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食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測

第12章

ELISA方法定量檢測抗農(nóng)達(dá)(Roundup

Ready)轉(zhuǎn)基因大豆

F．Eyquem

轉(zhuǎn)基因大豆ELISA方法定量檢測抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)2

目錄

第12章

ELISA方法定量檢測抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)轉(zhuǎn)基因大

豆

引言3

酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)技術(shù)7實(shí)驗(yàn)部分10

轉(zhuǎn)基因大豆ELISA方法定量檢測抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)3

引言

本章介紹一種用免疫學(xué)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因植物的方法，這種方法是基于對轉(zhuǎn)化事件中轉(zhuǎn)入基因產(chǎn)生的新蛋白的檢測。但是，值得注意的是，基因修飾并不總是直接特異地對應(yīng)于產(chǎn)生新蛋白，蛋白表達(dá)量水平也并不總是足夠用于檢測的目的。另外，某些蛋白可能僅在植物的特定部位表達(dá)(如：組織特異性啟動子)，或者在不同部位或不同生理時期其表達(dá)量水平也不一樣。

有報道稱植物中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表達(dá)量水平占總可溶性蛋白的0~2%，甚至在一些強(qiáng)啟動子植物中也是如此(Longstaff，1995)。然而，在許多情況下，文獻(xiàn)資料報道的轉(zhuǎn)入基因蛋白表達(dá)量水平(如：批準(zhǔn)的GM作物)一般低于2%的表達(dá)上限(henner，1997)。

免疫學(xué)分析是一種用抗體作為檢測試劑的分析測定系統(tǒng)。抗體是一種從動物血清中分離得到的特異性蛋白，它可特異性地結(jié)合于誘導(dǎo)它們產(chǎn)物的底物，即抗原。抗體的制備是通過將待檢測的底物(如：CP4EPSPS，是一種產(chǎn)生農(nóng)達(dá)除草劑抗性的蛋白)注射到動物如兔子或者老鼠體內(nèi)，然后動物體內(nèi)的細(xì)胞會將此底物識別為外來物質(zhì)并產(chǎn)生抗體與之對抗?？贵w經(jīng)過純化，并用可檢測的標(biāo)記與之連接，然后可作為檢測目標(biāo)底物的試劑。

免疫學(xué)檢測方法發(fā)展和應(yīng)用的先決條件是：得到可直接和待檢測新蛋白作用的高特異性抗體。另外，目標(biāo)樣品或蛋白不能有明顯的降解。

在對復(fù)雜基質(zhì)中的抗原進(jìn)行定量的檢測中，抗體是一個很有用的生物學(xué)工具。所有的免疫學(xué)分析都是基于抗原和抗體之間的特異性結(jié)合。

抗體-抗原相互作用

當(dāng)免疫學(xué)家將抗體的本質(zhì)確定為蛋白質(zhì)時，對于抗體的大多數(shù)描述都包括：這些分子具有將抗原從溶液中沉淀出來的能力，盡管現(xiàn)在抗體沉淀性質(zhì)已經(jīng)很少用于實(shí)驗(yàn)性分離和檢測抗原，除了在一些自身免疫疾病中抗體也很少在體內(nèi)沉淀抗原?？贵w沉淀反應(yīng)的作用，如圖1所示，地說明了抗體分子基本和普遍的特性。這個實(shí)驗(yàn)同時說明了其他的一些問題：

血清抗體(IgG)在與抗原反應(yīng)時是二價的，它與抗原可以發(fā)生交聯(lián)(cross-link)；抗原與抗體反應(yīng)時一般是多價的；

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血清抗體在自然情況下都以多克隆形式存在；

抗體可以高度特異性地識別抗原分子的結(jié)構(gòu)。

圖1.單抗原及其抗體系統(tǒng)的沉淀曲線

以抗體沉淀量和逐漸增加的抗原濃度(抗體總量恒定)作沉淀曲線，可分為3個區(qū)域(圖1)：

“抗體過量區(qū)”，在這個區(qū)域，抗體沉淀被抑制，可在上清液中檢測到過量的抗體?！暗葍r區(qū)”，在這個區(qū)域，沉淀量達(dá)到最大，抗原抗體形成大的不溶性抗原抗體復(fù)合物(藍(lán)色顯示)，上清液中檢測不到抗原和抗體的存在。

抗原抗體沉淀反應(yīng)能很好地描述多克隆抗體和多價抗原之間的相互作用，但一般地，它不適合于描述抗原和單克隆抗體之間的相互作用，除非抗原表現(xiàn)出多種一致的抗原決定簇(如，在多糖中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)碳架結(jié)構(gòu))，只有在這時，特異性的單克隆抗體才能交聯(lián)并沉淀抗原。盡管如此，單克隆抗體有更簡練的方法來描述其生物學(xué)特征，這些方法提供了關(guān)于抗體抗原相互作用的一些詳細(xì)信息，如平衡常數(shù)和動力學(xué)開關(guān)速率。

抗體能非常有效的用來檢測和分離抗原。化學(xué)修飾可以改變抗體的結(jié)構(gòu)但是不破壞它們與抗原結(jié)合的能力，使得抗體的相對穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而使抗體的應(yīng)用也大大加強(qiáng)?？贵w食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測第12章

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可以通過化學(xué)方法，用熒光、磁性、放射性或其它化合物進(jìn)行標(biāo)記，使其在不同的實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)對抗原的檢測和分離。

如何制備單克隆抗體

抗原對于人體來說是外源物質(zhì)，如致病性細(xì)菌和病毒，以及其它侵染性物質(zhì)，它們可被人體的免疫系統(tǒng)作為入侵者而被識別?？贵w是我們體內(nèi)抵御這些侵染性物質(zhì)的天然防線，可以識別抗原并有助于破壞抗原蛋白。

抗體非常有用的兩個性質(zhì)是，首先，它們是高度特異的；即每個抗體只能特異地結(jié)合和攻擊一個特定的抗原。其次，有些抗體一旦被一種疾病激活，它將持續(xù)對這種疾病產(chǎn)生抗性。

利用抗體的第二個特點(diǎn)就可以發(fā)展疫苗。疫苗是一種弱化或者滅活的細(xì)菌或病毒，當(dāng)它們被接種到人體中時，可以激活人體產(chǎn)生抗體抵御它所攜帶的抗原。

抗體的特異性使單克隆抗體技術(shù)變得價值非凡。抗體不僅僅可以用于醫(yī)療，抵御疾??；它們也可以幫助診斷一系列的疾病，檢測藥物、病毒和細(xì)菌產(chǎn)物、以及血液中其它不常見或不正常的物質(zhì)。

由于這種抗病物質(zhì)(即抗體)的多樣化使用，抗體的純化質(zhì)量一直以來都是科學(xué)研究所關(guān)注的焦點(diǎn)?？贵w制備傳統(tǒng)的方法是向?qū)嶒?yàn)動物注射抗原，等抗體形成后，從動物的血清中回收抗體(含有血清的抗體稱為抗血清)。這種制備方法存在兩個問題：它產(chǎn)生的抗血清中包含有其它一些不需要的物質(zhì)，而且這種方法所產(chǎn)生的抗體的量是非常少的。

通過使用一種能在自然條件下產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，和一類在培養(yǎng)條件下可以持續(xù)生長的細(xì)胞，單克隆抗體技術(shù)可以產(chǎn)生大量的高純度的抗體。如果我們能將這種“不死”的特性，和這種可以產(chǎn)生我們需要的抗體物質(zhì)的特性結(jié)合起來，實(shí)際上，我們就得到了一個連續(xù)工作的生產(chǎn)抗體的工廠。

在單克隆抗體技術(shù)中，有連續(xù)繁殖能力的腫瘤細(xì)胞，和產(chǎn)生抗體的哺乳動物細(xì)胞融合。這種融合細(xì)胞稱為“雜交瘤細(xì)胞”，它可持續(xù)產(chǎn)生抗體。因?yàn)樗鼈兌际莵碓从谕活愋偷募?xì)胞-雜交瘤細(xì)胞，這些抗體就被稱為單克隆抗體；另一方面，由傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的抗食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測第12章

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體是來源于多種類型的細(xì)胞，因此它們稱為多克隆抗體。下邊介紹一個單克隆抗體制備的例子。

單克隆抗體的制備

骨髓瘤細(xì)胞是一種骨髓中的腫瘤細(xì)胞，它可以在細(xì)胞培養(yǎng)中不停的生長。當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的哺乳動物脾細(xì)胞融合，其結(jié)果產(chǎn)生雜交的細(xì)胞，稱為雜交瘤細(xì)胞，它可以產(chǎn)生大量的單克隆抗體。這種細(xì)胞融合的產(chǎn)物集合了兩個不同類型細(xì)胞的特性：持續(xù)生長的能力和產(chǎn)生大量高純度抗體的能力。

因?yàn)檫x擇性的雜交細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體，其純度比傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的多克隆抗體高很多。在對抗疾病方面，它們與傳統(tǒng)的藥物相比具有更高效的潛力，因?yàn)樗幬锊粌H攻擊外來物質(zhì)，同時也會攻擊人體自身的細(xì)胞，有時也產(chǎn)生一些不期望的副作用如過敏反應(yīng)。單克隆抗體僅僅攻擊目標(biāo)分子，它不會產(chǎn)生副作用，或使副作用大大減少

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酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)技術(shù)

定義

酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)是指：應(yīng)用一個酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)物(抗原或抗體)和一個免疫吸附劑(結(jié)合在固體支持物上抗原或抗體)的酶免疫分析，通過不同的方法(如：在標(biāo)記的反應(yīng)物和未標(biāo)記的未知樣品之間的競爭結(jié)合)，可用于測定未知樣品的濃度。

ELISA(ClarkandAdams，1977)依賴于抗原抗體之間的特異性反應(yīng)。ELISA中的關(guān)鍵試劑是抗體，它是免疫系統(tǒng)應(yīng)答于外來物質(zhì)(抗原)侵染而產(chǎn)生的一種可溶性蛋白。對于轉(zhuǎn)基因的檢測，抗原則是新產(chǎn)生的蛋白。

在轉(zhuǎn)基因植物中，插入的基因會產(chǎn)生新蛋白?？梢杂肊LISA的方法來評估此蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量的水平。關(guān)于特異性抗體的生產(chǎn)和應(yīng)用的信息，在許多報道轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展的文章中可以找到(Mohapatraetal.，1999)。

至今，商業(yè)化的能夠直接應(yīng)用于批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因作物插入基因蛋白產(chǎn)物的特異性抗體還很少：有一些抗體是針對于nptII基因產(chǎn)物NPTII或APH(3')II，和針對gus基因的產(chǎn)物。

下圖是進(jìn)行ELISA檢測的3種不同方法：

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基于ELISA的抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)轉(zhuǎn)基因大豆特異性檢測的方法由Lipp等(2000)建立、測試和驗(yàn)證。

此方法的建立是基于CP4-EPSPS(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，此酶來源于Agrobacteriumsp.strainCP4)(Padgetteetal.,1995)蛋白特異性抗體的使用。CP4-EPSPS蛋白賦予RoundupReady大豆抗農(nóng)達(dá)除草劑的特性。初步結(jié)果表明，此方法(操作中使用商業(yè)化的ELISA試劑盒)可以檢測大豆原料中的轉(zhuǎn)基因成分含量范圍在0.3%到5%之間。原理

下圖表示的是用于檢測CP4-EPSPS蛋白的三明治式ELISA示意圖：

微量滴定板的表面包裹著特異性單克隆捕獲抗體。

當(dāng)加入含有待檢測蛋白的樣品時，捕獲抗體與抗原結(jié)合。

樣品中沒有結(jié)合的成分可被洗脫除去。

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洗脫之后，加入一種與辣根過氧化物酶(HRP)共價偶聯(lián)的多克隆抗體，該抗體可與CP4EPSPS蛋白的另一個抗原位點(diǎn)特異結(jié)合

洗脫后，加入辣根過氧化物酶的顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。辣根過氧化物酶可催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顏色信號與抗原濃度在線性范圍內(nèi)呈一定的比例。顯色一定時間后，加入終止液終止反應(yīng)。在450nm波長處測量每一孔的光密度。

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試驗(yàn)部分

(轉(zhuǎn)基因食品成分檢測，大豆試劑盒使用說明(1999)。SrategicDiagnostics,Inc.,Rev.052099,Vers.1.8.)1

引言

下面的程序詳細(xì)描述了基于ELISA法檢測農(nóng)產(chǎn)品原材料及其加工產(chǎn)品中抗農(nóng)達(dá)大豆表達(dá)的CP4EPSPS蛋白，如大豆粉和大豆蛋白分離物。

此方法應(yīng)用于只經(jīng)少許處理或未經(jīng)處理的CP4EPSPS蛋白未變性的樣品。例如，食品成分經(jīng)高溫處理可能會影響到蛋白檢測結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示食品成分在溫度不高于65℃下處理少于60分鐘時，其檢測結(jié)果是可信的。

此方法已經(jīng)驗(yàn)證可作為CP4EPSPS蛋白的檢測方法，若應(yīng)用特異的參考物質(zhì)，其樣品中CP4EPSPS蛋白的檢測濃度范圍可從0.3%到5%(w/w)。使用一個修改的程序，試劑盒也可以檢測低至0.05%到0.3%濃度范圍的樣品。

儀器設(shè)備

15ml錐形聚丙烯離心管

1275mm玻璃試管

塑料薄膜或鋁膜

塑料膠帶或盤清洗機(jī)

洗液瓶，如：500ml的

可分裝20μl到500μl的精確微量移液器

漩渦混合器

稱量紙

1本章中描述的試劑盒是在組織培訓(xùn)課程和編寫手冊時唯一驗(yàn)證可用的商業(yè)化程序，JRC和WHO并不推薦任何特定品牌的商業(yè)化試劑盒。

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刮刀

精確到0.01g的天平

轉(zhuǎn)速達(dá)到5000到10000rpm離心機(jī)

可以讀取450nm吸光值的酶標(biāo)儀

37℃的恒溫箱

孔徑450m的濾膜

孔徑150m的濾膜

多通道移液器。如50l到300l(可選)

可多通道分裝的試劑容器(可選)

自動清洗機(jī)(可選)

15ml離心管架(可選)

試劑

概述

在分析中，除另有規(guī)定外，應(yīng)使用達(dá)到分析級別的試劑和去離子水或蒸餾水。

對規(guī)定中操作標(biāo)準(zhǔn)的任何偏離都可能會影響到試劑的穩(wěn)定性。應(yīng)該丟棄基質(zhì)成分由澄清變成藍(lán)色的試劑。不能使用已經(jīng)變混濁的緩沖液。

試劑盒中所有試劑都應(yīng)該保存在2~8℃條件下。試劑盒成分的貨架期與其成分的有效期相同?；诜€(wěn)定性測試，試劑盒在2~8℃條件下其有效期為9個月。偶聯(lián)抗體儲藏液和偶聯(lián)抗體工作液應(yīng)該在其試劑盒有效期內(nèi)保存在2~8℃條件下。稀釋的工作洗脫液應(yīng)該儲藏于大約2~8℃條件下，不能使用超過有效期的試劑盒。

檢測試劑盒通常提供的試劑

大豆抽提緩沖液，硼酸鈉緩沖液，pH7.5

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大豆分析緩沖液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，Tween20，牛血清蛋白(BSA)，pH7.4包被有單克隆捕獲抗體的酶標(biāo)板

大豆偶聯(lián)抗體，凍干的兔抗CP4EPSPS蛋白

大豆偶聯(lián)抗體稀釋液，10％熱滅活的小鼠血清

顯色底物，K-BlueTM，四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，過氧化氫，5%二甲基甲酰胺(dimethylformamide)作為溶劑。

終止液，0.5%硫酸

10倍濃縮的洗脫緩沖液，PBS，Tween20，pH7.1。

陰性和陽性參照標(biāo)準(zhǔn)

程序

程序的使用范圍

ELISA-GM檢測體系只限于檢測CP4EPSPS蛋白表達(dá)與參照標(biāo)準(zhǔn)中GM材料含量相關(guān)的樣品。

ELISA檢測試劑盒最適操作環(huán)境溫度在15~30℃之間。參照標(biāo)準(zhǔn)的最高吸光值應(yīng)當(dāng)高于0.8，吸光值不能落在分光光度計的線性范圍以外(不同的分光光度計有不同的線性上限)。應(yīng)該考慮到吸光值(OD)在30℃以上會很快上升，因此，如果溫度較高，就應(yīng)該降低底物溫育時間。而在溫度較低時(低于15℃)，應(yīng)該加長底物溫育時間。

樣品制備過程中避免污染的方法

概述.ELISAGMO檢測體系具有很高的靈敏度，非常少量的GM污染都會影響檢測的結(jié)果。因此不同批次樣品處理操作中必須對過程中使用的所有儀器進(jìn)行徹底的清洗。以下程序包括：第一步盡量去除顆粒物質(zhì)，第二步乙醇清洗，可使樣品變性，這樣可使留在儀器上的任何可檢測的GM蛋白失去活性?；旌掀骰驍嚢铏C(jī)清洗.使用柔軟的毛刷清洗。定期地清洗毛刷并在酒精中浸泡。使用之前將毛刷晾干。用柔軟的衣物或?qū)嶒?yàn)室毛巾拭擦。

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用酒精沖洗，可用噴壺沖，建議沖洗兩次。然后再用清水沖洗。在空氣中干燥，如果急用的話，可以用吹風(fēng)機(jī)吹干。

濾網(wǎng)清洗.濾網(wǎng)容易被大豆粉堵塞，在硬的表面輕輕拍打?yàn)V網(wǎng)以去除堵塞物質(zhì)。

使用柔軟的毛刷清洗。定期的清洗毛刷并在酒精中浸泡至少一分鐘。使用之前將毛刷晾干。用柔軟的衣服拭擦。用酒精沖洗至少5min，然后再用清水沖洗。在空氣中干燥，如果急用的話，可以用吹風(fēng)機(jī)吹干。

也可用超聲波清洗，然后空氣中干燥。

工作區(qū)域的清潔.對于工作區(qū)域的清潔也是非常重要的。因?yàn)榇朔治龇椒`敏度高，少量的轉(zhuǎn)基因陽性粉末污染都可能造成假陽性的結(jié)果出現(xiàn)。應(yīng)避免大豆粉末污染工作區(qū)域。不允許大豆粉末的處理污染后面過程中用到的儀器。為了得到最好的結(jié)果，樣品混合和制備的區(qū)域和設(shè)施應(yīng)該和實(shí)驗(yàn)分析的地方分開來，以避免可能存在的粉末污染。樣品制備

均質(zhì)的子樣品應(yīng)取之于實(shí)驗(yàn)室樣品。

如果實(shí)驗(yàn)室樣品是大豆原材料，取500g以上大豆，放在合適的攪拌機(jī)上粉碎大約三分鐘，直至可通過微孔濾網(wǎng)過濾。定量檢測的樣品顆粒大小應(yīng)小于150m，定性檢測的樣品顆粒大小應(yīng)小于450m。過濾過程中應(yīng)小心污染，并避免局部過熱。攪拌機(jī)的作用是混合和粉碎樣品。

從研磨的的材料中取大約100g左右可通過450m微孔濾網(wǎng)(40目)的子樣品，保證子樣品的90％以上可通過450m微孔濾網(wǎng)。定性檢測分析可直接使用篩選的樣品，定量檢測分析應(yīng)進(jìn)一步經(jīng)孔徑為150m的微孔濾網(wǎng)過濾篩選的樣品。通過450m微孔濾網(wǎng)的材料大小可認(rèn)為是均一的，因此篩選通過150m微孔濾網(wǎng)的最終樣品只要夠量就可以。

對于其它類型的材料，甚至顆粒更小的樣品應(yīng)采用類似的方法處理。

分析程序

所有的試劑在使用前都要先回復(fù)至室溫。

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從鋁箔包裝袋中取出包被的酶標(biāo)條和酶標(biāo)條固定架，每次取出適量的酶標(biāo)條后重新密封包裝袋。檢測條上的十個孔是用來做參照標(biāo)準(zhǔn)和空白對照的。每快板都應(yīng)有一個標(biāo)準(zhǔn)和對照。如果使用手動清洗，將酶標(biāo)條的邊緣用膠帶粘到固定架上以防止在清洗時檢測條會突然掉下來。

偶聯(lián)抗體的制備偶聯(lián)抗體儲備液：從大豆偶聯(lián)試劑瓶(SoyaConjugatebottle)中吸取1ml的大豆偶聯(lián)稀釋液(SoyaConjugateDiluent)到大豆偶聯(lián)連接液(SoyaConjugatevial)中，旋轉(zhuǎn)混合大約10s。偶聯(lián)抗體工作液：吸取240l重構(gòu)大豆偶聯(lián)液(reconstituteSoyaConjugate)到大豆偶聯(lián)稀釋液瓶(SoyaconjugateDiluentbottle)中。標(biāo)記日期，翻轉(zhuǎn)混合20次。

洗脫緩沖液的制備

將10的洗脫緩沖液回復(fù)到室溫。

用去離子水稀釋10的洗脫緩沖液，制備成為洗脫緩沖工作液(例如：50ml的10洗脫緩沖液加入到450ml去離子中)。

將洗脫緩沖液工作液加入到自動清洗儀或洗瓶中。

樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)的抽提

實(shí)驗(yàn)樣品、陰性及陽性參照標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下抽提，每個兩次重復(fù)，可描述如下。樣品稱量時，按照濃度由低到高的順序先稱取參照標(biāo)準(zhǔn)，然后是實(shí)驗(yàn)樣品。

每一種參考標(biāo)準(zhǔn)和樣品稱取0.5g0.01g，分別放入15ml聚丙烯離心管中。為避免污染，每次稱量前要擦凈抹刀。

向每個離心管中加4.5ml大豆抽提緩沖液，旋渦混合10s。

5000rpm離心15min。

用移液器小心吸取上清液于另一干凈的15ml聚丙烯離心管中，并做標(biāo)記，不要吸到粒子物質(zhì)。

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開始檢測前，用大豆檢測緩沖液按照表1所列比例稀釋樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)抽提物。蛋白抽提物于2~8℃貯存，時間不超過一個工作日。

表1.不同基質(zhì)的稀釋范圍

基質(zhì)稀釋

大豆1:300

大豆粉

脫脂豆粉1:3001:300

蛋白抽提物1:10

樣品抽提物的稀釋

對于抽提的陰性對照、陽性對照和樣品的稀釋需要用到兩個1275mm的實(shí)驗(yàn)管完成。

吸取280l大豆檢測緩沖液到其中的一個1275mm實(shí)驗(yàn)管。

吸取380l大豆檢測緩沖液到另一個1275mm實(shí)驗(yàn)管。將280l的實(shí)驗(yàn)管標(biāo)記為“1:15”，將380l的實(shí)驗(yàn)管標(biāo)記為“1:300”。

每個樣品吸取20l到標(biāo)記為“1:15”的實(shí)驗(yàn)管，渦旋混勻。

從標(biāo)記為“1:15”的檢測板吸取20l到標(biāo)記為“1:300”的檢測板，渦旋混勻。同樣的方法稀釋陰性對照、陽性對照和樣品抽提物。

ELISA操作程序

概述

ELISA檢測試劑盒可以以不同的形式在8孔檢測條上使用。建議使用隨機(jī)加樣方案。所有的反應(yīng)孔都應(yīng)重復(fù)兩次，然后計算其吸光值的平均值。每個程序都要包括分析緩沖液空白、陰性對照和陽性參照標(biāo)準(zhǔn)。

食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測第12章

轉(zhuǎn)基因大豆ELISA方法定量檢測抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)16

當(dāng)檢測開始后，所有的步驟都應(yīng)該連續(xù)進(jìn)行而不能中斷。

加樣

加100l稀釋的提取液和檢測空白到對應(yīng)的孔內(nèi)。

每次移液使用一次性槍頭以避免交叉污染。

使用膠帶或鋁箔封住酶標(biāo)板，以免污染和蒸發(fā)。

樣品溫育

37℃，微量滴定板溫育1h。

洗脫

用300l洗脫緩沖液洗脫酶標(biāo)板3次。人工洗滌：將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)，倒出微孔內(nèi)液體。用裝有洗滌工作液的500ml洗瓶，將每孔注滿洗滌液，保持60s，然后翻轉(zhuǎn)，倒掉洗滌液。如此重復(fù)操作3次。在多層紙巾上將酶標(biāo)板倒拍數(shù)次，以去除殘液和泡沫。

用膠帶將酶標(biāo)條固定以免滑落。自動洗滌：溫育完畢，用微量清洗器將所有孔中的液體吸出，然后在每孔內(nèi)加滿洗脫緩沖液。如此重復(fù)3次。最后，用微量清洗器吸出所有孔中洗脫液，在多層紙巾上將酶標(biāo)板反放拍干，以去除殘液和泡沫。

在此過程中，不要讓酶標(biāo)孔全干，否則會影響分析結(jié)果；

不管是人工洗滌還是自動洗滌，應(yīng)確保每一孔用相同體積的洗脫液洗滌，不充分地洗滌會導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

加入偶聯(lián)抗體

向每個孔加入100μl偶聯(lián)抗體工作液

蓋上蓋子防止污染和蒸發(fā)

溫育

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37℃，微量滴定板溫育1h。

洗滌

溫育結(jié)束后，重復(fù)前面用到的洗滌步驟。

加入底物

每孔中加入100l顯色溶液。

輕輕搖動酶標(biāo)板，室溫溫育10min。

加顯色底物時應(yīng)連續(xù)一次完成，不得中斷。

在移液操作中保持相同次序和時間間隔。酶標(biāo)板應(yīng)注意避光，防止顏色的亮度因受到光的影響而發(fā)生變化。

加入終止緩沖液

溫育結(jié)束后，按照加入顯色底物同樣的順序向酶標(biāo)孔中加入100l終止液。

在加入終止液時應(yīng)連續(xù)一次完成，不得中斷，酶標(biāo)板應(yīng)注意避光，防止顏色的亮度因受到光的影響而發(fā)生變化。

測定吸光值

用酶標(biāo)儀在450nm波長測量每孔的吸光值(OD)。

在加入終止液30min之內(nèi)讀取吸光值。

記錄所得結(jié)果，計算平均吸光值或用計算機(jī)處理。

評估

標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)樣品及參照標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)值需減去檢測空白的數(shù)值，所測量的參照標(biāo)準(zhǔn)品的平均值用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)樣品的平均值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)濃度。

結(jié)果可信度判斷的原則

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每一輪檢測都必須符合結(jié)果可信度判斷的原則。每一輪反應(yīng)應(yīng)當(dāng)包括：空白、陰性標(biāo)準(zhǔn)品、陽性標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品。所有蛋白抽提物、空白對照都必須設(shè)置一個重復(fù)。如果不符合分析結(jié)果可信度判斷的條件，所有檢測實(shí)驗(yàn)需重新操作。

樣品

空白對照陰性標(biāo)準(zhǔn)品

2.5％陽性標(biāo)準(zhǔn)品

所有陽性標(biāo)準(zhǔn)品

未知樣品標(biāo)準(zhǔn)A450nm0.30A450nm0.30A450nm≥0.8重復(fù)的CV≤15％重復(fù)的CV≤20％

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