角蛋白結(jié)構(gòu)功能與角蛋白遺傳病

1角蛋白結(jié)構(gòu)功能與角蛋白遺傳病第1頁/共119頁角蛋白結(jié)構(gòu)功能

與角蛋白遺傳病

第2頁/共119頁3

角蛋白結(jié)構(gòu)與功能角蛋白遺傳病基因突變和臨床系列研究第3頁/共119頁4角蛋白簡介

角蛋白是上皮細胞的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成細胞骨架中間絲（微絲、微管、中間絲）第4頁/共119頁5角蛋白

目前已知49種,34種細胞角蛋白,15種毛發(fā)角蛋白Ⅰ型或酸性角蛋白（細胞角蛋白K9-10,K12-20,K23；毛細胞角蛋白Ha）Ha1-8,共25種Ⅱ型或堿性角蛋白（細胞角蛋白K1-K8；毛細胞角蛋白Hb）Hb1-6,共24種第5頁/共119頁研究背景第6頁/共119頁7K1，K10 角化上皮的基底上層 BCIE/EH,DNEPPKK2e 角化上皮基底上層的終末分化細胞 IBSK2p 硬腭特異性角蛋白 未發(fā)現(xiàn)K3,K12 角膜特異性角蛋白 MCDK4,K13 非角化的復(fù)層鱗狀上皮如食道 WSNK5,K14 表皮基底角質(zhì)形成細胞，復(fù)層上皮 EBSK6a,K6c-f,K16 掌跖，粘膜，傷口愈合時，表皮附屬器 PC-1K8,K18 單層上皮如肝,腎 隱匿性肝硬化K9 掌跖表皮 EPPKK15 基底角質(zhì)形成細胞 未發(fā)現(xiàn)K17,K6b 表皮附屬器，甲床，掌跖 PC-2K19 單層上皮，表皮附屬器 未發(fā)現(xiàn)K20 胃腸道上皮 未發(fā)現(xiàn)hHb6,hHb1 皮質(zhì)毛細胞 念珠狀發(fā)

角蛋白主要表達組織疾病第7頁/共119頁研究背景角蛋白的結(jié)構(gòu)

I型：II型：L1、L2、L12連接區(qū)（Linkerdomains)1A、1B、2A、2B螺旋區(qū)（Helicaldomains)V1、V2可變區(qū)（Variabledomains)H1、H2同源區(qū)（Homologyregions）ISISISIS基元（ISISmotif)S反向螺旋序列（Stuttersequence)

HIP/HTP2A第8頁/共119頁研究背景角蛋白基因結(jié)構(gòu)I型：II型：exons12345678introns1234567

exons123456789introns12345678

第9頁/共119頁10第10頁/共119頁11第11頁/共119頁12第12頁/共119頁13角蛋白不同結(jié)構(gòu)區(qū)氨基酸數(shù)統(tǒng)計角蛋白V1H11AL11BL122AL22BH2V2K16441443635111021719812120131K26451483635121011719812120128K3629162363514101171981222095K4534115363511102171981212050K5590132363512101171981212089K105611327351410116198121

108K144721087351110116198121

46K17432777351110116198121

37第13頁/共119頁14角蛋白序列的保守性

1.不同個體之間的保守性:1A起始部和2B末端15-20aa2.不同角蛋白之間的保守性螺旋起始區(qū):I型1A區(qū)第7個aa始LNDRLASYII型LNNKFASY

螺旋終止區(qū):EIATYRKLLEGE(如K12B末端倒數(shù)第5個氨基酸)第14頁/共119頁15角蛋白功能參與上皮細胞角化、分化；機械性支持維持細胞形態(tài)；細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、信息傳遞第15頁/共119頁16角蛋白基因敲除小鼠的表型角蛋白基因敲除表型K4白色海綿狀痣K5表皮基底層細胞溶解K6a創(chuàng)傷愈合延遲K6a/K6b舌上皮脆性增加K8胚胎死亡（C57BL/6小鼠）大腸增生（FVB/N小鼠）K8/K19胎盤缺陷，胚胎死亡K10表型輕微異常，無細胞溶解K12角膜脆性增加K14表皮基底層細胞溶解K17暫時性脫發(fā)K18肝臟病變K19無異常表型第16頁/共119頁17角蛋白與疾病

角蛋白疾病K1、K10大皰性魚鱗病樣紅皮病K5、K14單純型大皰性表皮松解癥K6、K16、K17先天性厚甲K8、K18隱匿性肝硬化K9表皮松解性掌跖角化癥hHb6、hHb1念珠狀發(fā)K7、K15、K19、K20不清楚第17頁/共119頁討論第18頁/共119頁討論角蛋白中間絲的裝配第19頁/共119頁20

角蛋白遺傳病基因突變和臨床系列研究第20頁/共119頁21技術(shù)路線和實驗方案患者家系基因突變分析收集患者家系臨床資料、病理標本、采集外周血提取外周血基因組DNAPCR擴增外顯子DNA序列分析患者正常人同源性分析確定基因突變位點排除多態(tài)性

第21頁/共119頁22先天性厚甲癥（Pachyonychiacongenita，PC）是一組常染色體顯性遺傳病，特點是甲營養(yǎng)不良和不同程度的外胚葉發(fā)育不良。第22頁/共119頁23根據(jù)臨床表現(xiàn)主要分為兩型PC-1表現(xiàn)為厚甲伴有局灶性掌跖角化、口腔粘膜白斑等。PC-2除具有PC-1的特征外還伴有胎生牙和多發(fā)性脂囊瘤。多發(fā)性脂囊瘤是PC-2最好的鑒別特征。

第23頁/共119頁24PC患者的厚甲通常是在出生后頭幾個月出現(xiàn)。一些PC患者甲改變發(fā)生較晚，稱為遲發(fā)性先天性厚甲。多發(fā)性脂囊瘤通常在青春期發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，PC-1由于角蛋白K16、K6a基因突變所致，PC-2由于角蛋白K17、K6b基因突變所致。第24頁/共119頁25先證者及其子的厚甲

第25頁/共119頁26先證者頭部多發(fā)性脂囊瘤

第26頁/共119頁27先證者及其子的多發(fā)性脂囊瘤第27頁/共119頁28先證者及其子的局灶性掌跖角化

第28頁/共119頁29第29頁/共119頁30第30頁/共119頁31研究方法

第31頁/共119頁32

1.血樣采集采集家系成員（包括9例患者、1例正常人）外周血3～5ml，2％EDTA抗凝，-70℃冷凍保存。另外抽取正常對照50人份外周血做同樣處理。33

2.外周血基因組DNA提取用全血基因組DNA純化試劑盒提取基因組DNA。

第33頁/共119頁343.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

選擇并合成引物：引物合成參照McleanWH等在NatureGenetics上的文獻。上游引物K17p8和下游引物K17p10。這對引物可使角蛋白K17基因外顯子1及其側(cè)翼序列得到選擇性擴增，擴增出978bp的DNA片段，并且避免了擴增兩個假基因ΨK17B和ΨK17C。

第34頁/共119頁35

K17P8和K17P10擴增的DNA片段稀釋1:10000倍作為巢式PCR模板。巢式PCR的上游引物序列為：5′-GCTGCTACAGCTTTGGCTCT-3′；下游引物序列為5′-CACGACGTTGTAAAACGACCAGTCACGGATCTTCACC-3′。第35頁/共119頁36PCR反應(yīng)：總體積為50μl,反應(yīng)液成分包括5μl緩沖液，10mmol/LdNTP1μl，25μmol/L上、下游引物各1μl，Taq酶0.5μl（2.5U），25mmol/LMgCl25μl,模板10μl。反應(yīng)條件：第36頁/共119頁374.基因測序

PCR產(chǎn)物采用全自動DNA測序儀進行序列測定，測序結(jié)果進行同源性分析。第37頁/共119頁38結(jié)果

第38頁/共119頁39

1.DNA提取結(jié)果

外周血全基因組DNA提取后電泳，可見其大小約為23kb（Marker為λDNAHindⅢ)。第39頁/共119頁402.PCR反應(yīng)結(jié)果PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，擴增出大小為978bp的DNA片段（Marker為DGL2000)。第40頁/共119頁41patientnormal第41頁/共119頁423DNA測序結(jié)果患者患者正常人正常人第42頁/共119頁43討論

第43頁/共119頁44

體外實驗表明，1A區(qū)起始部的突變對角蛋白裝配影響較大，而1A區(qū)后半部的突變對角蛋白裝配影響較小。臨床上發(fā)現(xiàn)的角蛋白突變位于1A區(qū)后半部的較少。第44頁/共119頁45角蛋白17模式圖及我們發(fā)現(xiàn)的突變位置第45頁/共119頁46我們發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)榻堑鞍譑17的N109D突變,為一新的錯義突變。因此，在進行中國人PC-Ⅱ型基因診斷或產(chǎn)前診斷時，除了參考國際上已報道的突變位點外，應(yīng)注意這一新的突變位點的可能性。第46頁/共119頁47

我們報道的這一PC-Ⅱ家系，厚甲均為遲發(fā)（10至20歲發(fā)生），基因突變位于K171A區(qū)的后半部，為一新的突變N109D。第47頁/共119頁48結(jié)合Connors等和我們的研究結(jié)果，K162B區(qū)中間部和K171A區(qū)后半部的基因突變可以呈現(xiàn)為遲發(fā)型厚甲。我們的研究結(jié)果表明角蛋白的突變位置與疾病的發(fā)生年齡有關(guān)。發(fā)生在角蛋白非關(guān)鍵部位的突變引起疾病遲發(fā)。第48頁/共119頁49通過2個家系初步的研究表明，中國PC-2型患者基因突變與其他種族相比，有相同之處，又有不同之處。本研究為進行中國人PC-2型基因診斷及產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ)。第49頁/共119頁50單純型大皰性表皮松解癥的

基因突變及臨床研究

InvestigationonGeneMutationsandClinical

PhenotypesofEpidermolysisBullosaSimplex

第50頁/共119頁結(jié)果1.臨床資料家系一

先證者，女，30歲。自述自幼年起至今，四肢末端，特別是手足部位受摩擦后出現(xiàn)黃豆至核桃大小水皰、大皰；在春夏季節(jié)發(fā)作較頻繁。家庭情況：先證者的女兒及母親生前有相同癥狀；父親、哥哥正常，未曾出現(xiàn)過類似皮損。

第51頁/共119頁結(jié)果雙足摩擦部位可見水皰、大皰第52頁/共119頁結(jié)果雙足跖可見大皰及灶狀角化過度第53頁/共119頁結(jié)果家系譜圖第54頁/共119頁結(jié)果散發(fā)病例一

患者，男，11歲。在出生后3天，雙足出現(xiàn)蠶豆至鴿卵大小的大皰，自行愈合，未留瘢痕；約在生后3、4月時，手足、四肢陸續(xù)出現(xiàn)水皰、大皰，軀干部位亦出現(xiàn)水皰，但主要集中在四肢遠端部位。就診時在四肢遠端可見散在的水皰、大皰以及水皰干涸后的結(jié)痂；家庭情況：父母正常，妹妹正常。

第55頁/共119頁結(jié)果雙手掌、腕部可見水皰、大皰第56頁/共119頁結(jié)果2.HE染色結(jié)果

水皰及裂隙看似位于表皮下

第57頁/共119頁結(jié)果3.PAS染色觀察

陽性反應(yīng)的基底膜位于裂隙的底部，提示水皰位于表皮內(nèi)。第58頁/共119頁結(jié)果皮損附近基底層細胞可見有空泡，提示水皰裂隙位于表皮內(nèi)。第59頁/共119頁結(jié)果4.透射電鏡觀察

D.真皮，E.表皮，BM.基底膜，☆水皰裂隙。

第60頁/共119頁結(jié)果雙足跖可見灶狀角化過度第61頁/共119頁結(jié)果散發(fā)病例二

患者，男，39歲，自述自幼年至約18歲期間，手足、小腿等部位頻繁出現(xiàn)水皰，自行愈合后不留瘢痕；在春夏季節(jié)發(fā)病較頻繁；成年后，發(fā)作次數(shù)明顯減少。雙足跖、趾腹承重部位灶性至彌漫性角化過度。指（趾）甲輕度至中度營養(yǎng)不良。家庭情況：其一子一女正常，父母生前無類似癥狀。第62頁/共119頁結(jié)果雙足跖、趾腹部可見灶狀至彌漫性角化過度。第63頁/共119頁結(jié)果指（趾）甲營養(yǎng)不良第64頁/共119頁結(jié)果散發(fā)病例一和散發(fā)病例二系譜關(guān)系見下圖

第65頁/共119頁結(jié)果K5基因外顯子4-5直接測序圖

患者DNA序列顯示第328密碼子的第二個堿基（↓）發(fā)生A→G雜合性突變（雙峰），氨基酸由甘氨酸替代天冬氨酸（GAC）。

健康者對照序列

第66頁/共119頁結(jié)果

K14基因外顯子1直接測序圖

對照健康人DNA序列

散發(fā)病例一的K14基因第661位出現(xiàn)雙峰，引起第115個密碼子由谷氨酸（GAG）變?yōu)橘嚢彼幔ˋAG）散發(fā)病例二發(fā)生同樣突變第67頁/共119頁結(jié)果K14基因外顯子1單核苷酸多態(tài)性（一）

50位健康人DNApool直接測序結(jié)果顯示第449位堿基為G（圖中★標記），密碼子（第44個）為絲氨酸（AGC）；GenBank序列相應(yīng)堿基為A，密碼子為天冬酰胺（AAC）。

TGCCGCGCCCCCAACACCTACG第68頁/共119頁結(jié)果

K14基因外顯子1單核苷酸多態(tài)性（二）

50位健康人DNApool直接測序結(jié)果顯示第687位堿基為C（圖中★標記），密碼子（第123個）編碼天冬酰胺（AAC）；GenBank序列相應(yīng)堿基為T，同樣為天冬酰胺（AAT）

CCTCAATGACCGCCTGGCCT

第69頁/共119頁結(jié)果

K5基因內(nèi)含子6核苷酸多態(tài)性

50位健康人DNApool直接測序結(jié)果顯示第3766～3768位堿基為AAA（圖中★標記）；GenBank序列相應(yīng)堿基為CCC。

GACCCAGCCCCTCAGAAGGAGA

第70頁/共119頁71EBS-DM家系基因突變研究第71頁/共119頁72第72頁/共119頁前言大皰性表皮松解癥（EpidermolysisBullosa,EB）是由于皮膚真表皮交界處結(jié)構(gòu)異常而引起的一組遺傳異質(zhì)性疾病，單純型大皰性表皮松解癥（EpidermolysisBullosaSimplex,EBS）是其中的一類。

EBS病因：角蛋白5或14的突變。第73頁/共119頁前言EBS研究現(xiàn)狀目前已有許多與EBS相關(guān)的突變報道，已總結(jié)出一些突變規(guī)律。但是新的基因突變的報道仍層出不窮。根據(jù)EBS發(fā)病率估計，我國大約有32000位EBS患者。而在此方面的研究報道很少。第74頁/共119頁研究背景單純型大皰性表皮松解癥的主要特征EBS-DM：1.水皰自新生兒期出現(xiàn)，泛發(fā)全身，多呈皰疹樣排列；2.口腔粘膜常受累及；3.常常伴有進行性掌跖角化過度，甲營養(yǎng)不良；4.在超微結(jié)構(gòu)下，裂隙位于表皮內(nèi)，基底層細胞漿內(nèi)有聚集成團塊的角蛋白中間絲；5.病情不隨季節(jié)變化而變化。6.絕大多數(shù)由HIP/HTP序列發(fā)生突變造成。第75頁/共119頁研究背景EBS-WC1.患者通常學習走路時開始出現(xiàn)水皰，主要發(fā)生在手足部位，部分患者僅在足部出現(xiàn)水皰；2.口腔粘膜通常不受累及；3.有時伴有灶狀的掌跖角化過度；4.在超微結(jié)構(gòu)下，裂隙位于表皮內(nèi)；5.病情在溫暖季節(jié)加重，涼爽季節(jié)減輕；6.由螺旋區(qū)和連接區(qū)突變引起。第76頁/共119頁研究背景EBS-K1.多數(shù)患者在出生時或生后不久出現(xiàn)水皰，少數(shù)在一歲內(nèi)出現(xiàn)癥狀；皮損泛發(fā)全身，但主要分布在手、足、肘、膝等部位；2.口腔粘膜也可以見到水皰；3.伴有掌跖角化過度,少數(shù)患者甲增厚，個別患者甲可脫落；4.在超微結(jié)構(gòu)下，裂隙位于表皮內(nèi)；5.病情在溫暖季節(jié)加重；6.多數(shù)由螺旋區(qū)突變引起。

第77頁/共119頁討論基因突變與表型的關(guān)系發(fā)生在角蛋白桿狀區(qū)的HIP和HTP片段：EBS-DM桿狀區(qū)的非高度保守序列：

EBS-K、EBS-WC有例外情況：如在K14基因HIP片段，M119T→EBS-DM，M119V→EBS-K，M119I→EBS-WC。第78頁/共119頁討論D328G突變位置：K5的L12連接區(qū)的第12氨基酸；L12區(qū)（K5和K14）：已發(fā)現(xiàn)16例突變多數(shù)：EBS-WC，3例EBS-K。第328位：天冬氨酸（GAC）→谷氨酸（GAA）、組氨酸（CAC）和纈氨酸（GTC）第79頁/共119頁討論E115K突變位置：H1片段末端并與HIP相連H1片段的作用：尚不清楚，Wilson等的實驗表明頭部缺失115個氨基酸（即包括全部H1區(qū)）的K14與K5只能形成極少量的中間絲，而且長度顯著縮短突變情況：未見報道；第80頁/共119頁81結(jié)論

在家系一患者K5基因中發(fā)現(xiàn)尚未報道過的新錯義突變—D328G；在兩例有血緣聯(lián)系的散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)K14新的同樣的錯義突變E115K；首次發(fā)現(xiàn)中國人群K14基因第449位堿基存在單核苷酸多態(tài)性：A→G突變；在中國人群K5基因第6內(nèi)含子第3766至3768位堿基（AAA）檢測到與報道不相同的序列(CCC)；第81頁/共119頁82論文題目：AnewmutationinL12domainofkeratin5inaChinesefamilywithWeber-CockayneEpidermolysisBullousSimplex發(fā)表刊物：ClinicalandExperimentalDermatology.2004,29(5):539-41第82頁/共119頁83先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病

1家系的基因突變研究

第83頁/共119頁84又稱表皮松解性角化過度,其臨床表現(xiàn)主要是出生時即有紅斑和水皰,隨著年齡增大，水皰可以得到改善，代之以表皮增厚和脫屑。成人以四肢屈側(cè)及皺褶部位棕褐色增厚或疣狀角化過度伴有少量的糜爛和松弛性水皰為特征。90%的患者在1歲時開始有皮膚損害,71%出生時就有。約有半數(shù)病人有陽性家族史。

第84頁/共119頁85第85頁/共119頁86先證者，男，42歲，自出生全身泛發(fā)過水皰，自幼掌跖角化過度，現(xiàn)頸部、肘部伸屈側(cè)、臀部、膝關(guān)節(jié)伸屈側(cè)角化過度，冬重夏輕，無瘙癢。

第86頁/共119頁87其次子15歲，自半歲起有廣泛的水皰、掌跖角化過度。現(xiàn)軀干皮膚彌漫性棕黃色的較厚角化過度性鱗屑，鱗屑脫落區(qū)露出粗糙的潮濕面,軀干、肘關(guān)節(jié)屈、伸側(cè)和膝蓋角質(zhì)樣的皮膚增厚上有干燥脫屑，有時出現(xiàn)水皰、大皰,冬重夏輕,無瘙癢。掌跖高度角化過度(圖1)。其長女、長子無異常（圖2）。

第87頁/共119頁88

第88頁/共119頁89組織病理表皮角化過度、顆粒細胞增厚變性,細胞核周圍見腔隙,乳頭瘤樣增生,真皮淺層個別血管周圍少量淋巴細胞,組織細胞浸潤(圖3)第89頁/共119頁90

第90頁/共119頁91

第91頁/共119頁92

第92頁/共119頁93第93頁/共119頁94對全部PCR產(chǎn)物測序后發(fā)現(xiàn)，該家系兩患者K1基因2號外顯子第623位堿基出現(xiàn)TC的雜合突變，家系中的正常人及50例無關(guān)正常人均無此種改變。此替代引起編碼角蛋白11A區(qū)第208位氨基酸的密碼子發(fā)生改變，使其編碼的氨基酸由亮氨酸變?yōu)楦彼幔↙208P）。第94頁/共119頁95第95頁/共119頁96角蛋白K1基因突變所致的BCIE的特征性臨床表現(xiàn)包括顯著的掌跖角化；角蛋白K10基因突變所致的BCIE有顯著的軀干受累，而無掌跖角化。

第96頁/共119頁97先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病1家系的基因突變研究結(jié)果被JournalofDermatologicalScience接受發(fā)表第97頁/共119頁98

先天性念珠狀發(fā)合并外耳道閉鎖的基因突變及臨床研究

第98頁/共119頁99第99頁/共119頁100第100頁/共119頁101第101頁/共119頁102男(■)女(●)患者男(□)女(○)健康者↗先證者ⅠⅡⅢⅣ表示世代數(shù)+被采血者++第102頁/共119頁103詳細詢問病史，全面體格檢查，明確臨床診斷。取患者病發(fā)制片在顯微鏡下觀察。外周血基因組DNA提取聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）:hHb6第7外顯子

DNA測序第103頁/共119頁104結(jié)果

第104頁/共119頁105

病發(fā)在顯微鏡下呈典型的念珠狀，結(jié)節(jié)和狹窄交替出現(xiàn)。病發(fā)發(fā)外和發(fā)內(nèi)未見菌絲和孢子。第105頁/共119頁106第106頁/共119頁107PCR產(chǎn)物2000160010007505002501泳道，DGL2000DNAMarker;2、3、4、5泳道，預(yù)期361bpPCR產(chǎn)物。第107頁/共119頁108圖5（a）先證者第一次測序結(jié)果：示E402K突變，GAG→AAG

圖5（b）先證者第二次測序結(jié)果：示E402K突變，GAG→AAG

第108頁/共119頁109圖5（c）先證者之父第一次測序結(jié)果：示E402K突變，GAG→AAG圖5（d）先證者之父第二次測序結(jié)果：示E402K突變，GAG→AAG

第109頁/共119頁110圖5（e）50人份正常人DNA測序結(jié)果：示E402密碼子，GAG人hHb6基因的