土壤酶的測定方法

--本頁僅作為文檔封面，使用時(shí)請直接刪除即可----內(nèi)頁可以根據(jù)需求調(diào)整合適字體及大小--一、脲酶測定（比色法）脲酶是對尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶，它的酶促反應(yīng)產(chǎn)物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用來表示土壤供氮能力。1、試劑配制：（1）檸檬酸鹽溶液：取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水中，另取295g氫氧化鉀溶于水，再將兩種溶液合并，用1N氫氧化鈉將pH調(diào)至，并用水稀釋至2L。（2）苯酚鈉溶液：稱取苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和丙酮，后用乙醇稀釋至100mL（A液），保存再冰箱中。稱取27g氫氧化鈉溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B兩液各20mL混和，并用蒸餾水稀釋至100mL備用。（3）次氯酸鈉溶液：用水稀釋制劑至活性氯的濃度為％，溶液穩(wěn)定。（4）10%尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5）N的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取硫酸銨溶于水稀釋至1L,則得1mL含的標(biāo)液，再將此液稀釋10倍制成氮工作液（mL）。2、操作步驟稱取5g土置于50mL容量瓶中，加1mL甲苯處理,加塞塞緊輕搖15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的檸檬酸鹽緩沖液（pH,仔細(xì)混勻。在37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h。然后用熱至38C的蒸餾水稀釋至刻度（甲苯應(yīng)浮在刻度以上），搖蕩，將懸液過濾。取濾液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至10mL,然后加入4mL苯酚鈉溶液,并立即加入3mL次氯酸鈉溶液，加入每一試劑后，立即將混合物搖勻,20min后,將混合物稀釋至刻度，在波長578nm處測定吸光值。服酶活性以樣品所得的吸光值減去對照樣品吸光值之差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸餾水至20mL，再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色，定容°1h內(nèi)再分光光度計(jì)上于578nm處比色。3、結(jié)果計(jì)算以24小時(shí)后1g土壤中NH3-N的質(zhì)量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure=a?V?n/m式中：a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N濃度（mg/mL）；V為顯色液體積（50mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。二過氧化氫酶測定（容量法）（比較好測）試劑配制%過氧化氫溶液：按1:100將30%H202用水稀釋3N硫酸（）高猛酸鉀（1/5KMnO4）溶液：稱取化學(xué)純高猛酸鉀，溶于1升無CO2蒸餾水中，貯于綜色瓶中，備用。操作步驟（1）取2g風(fēng)干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL%H202^液。（2）同時(shí)設(shè)置對照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL%過氧化氫溶液，而不加土樣。（3）將三角瓶放在振蕩機(jī)上振蕩20min后，加入5mL3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過濾。吸取25mL濾液，用高猛酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算用于滴定土壤濾液所消耗的高猛酸鉀量（毫升數(shù)）為B,用于滴定25mL原始的過氧化氫混合液所消耗的高猛酸鉀量（毫升數(shù)）為A。（A-B）XT即為過氧化氫酶活性。以20min后1g土壤的高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。。式中T為高猛酸鉀滴定度的校正值。（就是最后換算成每克，所以還要測土壤含水量）高猛酸鉀溶液標(biāo)定稱?。?zhǔn)至）于105~110°C烘至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高猛酸鉀溶液［c（KMnO4）=l］滴定，近終點(diǎn)時(shí)加熱至65C,繼續(xù)滴定至溶液呈粉紅色保持30s,同時(shí)作空白試驗(yàn)。高猛酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計(jì)算c（1/5KMnO）=m/（V1-V2）*4式中c（1/5KMnO）二一高猛酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液之物質(zhì)的量濃度，4mol/L；m草酸鈉之質(zhì)量，g；V1——高猛酸鉀溶液之用量，mL；V2——空白試驗(yàn)用高猛酸鉀溶液之用量，mL；——與高猛酸鉀溶液c（1/5KMnO）=l相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟?酸鈉的質(zhì)量。三、蔗糖酶測定（比色法）：1、試劑配制（1）3,5一二硝基水楊酸溶液：稱二硝基水楊酸，溶于20mL2N氫氧化鈉和50mL水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至100mL（不超過7天）。（2）磷酸緩沖液:1/15M磷酸氫二鈉（磷酸氫二鈉.12HO溶于1L蒸餾水中）2加1/15M磷酸二氫鉀（磷酸二氫鉀溶于1L蒸餾水中）即成。（3）8%蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中（4）甲苯（5）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：將葡萄糖預(yù)先在80°C烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸餾水中，即成標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（5mg還原糖/mL）。再將次液稀釋10倍制成葡萄糖工作液mL）。2、操作步驟稱取5g過1mm篩的風(fēng)干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL8%蔗糖溶液，5mLpH磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37C下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過濾。從中吸取濾液1mL,注入50mL容量瓶中，加3mL3,5—二硝基水楊酸，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3—氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長508nm處比色。每一土壤需做無基質(zhì)對照，整個(gè)試驗(yàn)需做無土壤對照。在分析樣品的同時(shí)，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分別注入50mL容量瓶中，并按與測定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色，比色后以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、結(jié)果計(jì)算以24h后1g土壤中葡萄糖的質(zhì)量（mg）表示蔗糖酶活性（Sue）：Suc=a?V■n/m式中：a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖濃度（mg/mL）；V為顯色液體積（50mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。4.磷酸酶測定（磷酸苯二鈉比色法）：土壤磷酸酶是植物根系與微生物的分泌產(chǎn)物。磷酸酶與土壤P素轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，是土壤P素肥力的指標(biāo)。1、試劑配制（1）甲苯（2）磷酸笨二鈉：稱取磷酸笨二鈉（）溶于水，并稀釋至1L（1毫升含25mg酚）（3）緩沖液（4）pH硼酸鹽緩沖液緩沖溶液配制：（1）酸性磷酸酶:醋酸鹽緩沖液（pH=A：醋酸鈉溶液：無水醋酸鈉或炊阮）溶于1OOOmL蒸餾水中，或是三水醋酸鈉。溶于100誠水

中。B：醋酸溶液：醋酸定容于1000mL醋酸鹽緩沖液（pH=：7mLA+3mLB混合即得（2）堿性磷酸酶：硼酸鹽緩沖液（）硼砂一氫氧化鈉緩沖液（）：A：硼砂液：硼砂溶于1000mL蒸餾水中B：氫氧化鈉溶液：4g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中50mLA+43mLB加水稀釋至200mL，混勻即得（3）硼酸鹽緩沖液（）A：硼砂溶液：硼砂（阮腫雙2°）溶于1000mL蒸餾水中B：硼酸溶液：硼酸（曄々溶于1000mL蒸餾水中

硼酸鹽緩沖液（）：80mLA+20mLB混勻即得（4）中性磷酸酶：檸檬酸鹽緩沖液（）A：檸檬酸溶液：檸檬酸."（或是）溶于100誠蒸餾水中B:磷酸氫二鈉：磷酸氫二鈉.2財(cái)（磷酸氫二鈉.7"或是磷酸氫二鈉傘4°）溶于100誠蒸餾水中

檸檬酸鹽緩沖液（）：+混勻即得（5）%鐵氰化鉀（6）%的4—氨基安替毗啉溶液（7）酚原液：2克酚溶液蒸餾水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中穩(wěn)定。（8）酚工作液：取原液稀釋至100mL（酚/mL）2、操作步驟：稱取5g土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞緊輕搖15min。再加入5mL磷酸苯二鈉（溶于1L水）和5mL相應(yīng)的緩沖液（酸性磷酸酶用pH大醋酸緩沖液，中性磷酸酶用的檸檬酸緩沖液，堿性磷酸酶用pH10的硼酸緩沖液），同時(shí)對每一土樣都設(shè)置用5mL水代替基質(zhì)的對照。仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，在37°C下培養(yǎng)24ho用熱至38C的蒸餾水將容量瓶中混合物稀釋至刻度（甲苯浮在刻度以上），再用致密濾紙過濾。取1mL濾液于100mL容量瓶中，加5mLpH硼酸鹽緩沖液，再加入3mL%的鐵氰化鉀和3mL%的4—氨基安替毗啉溶液，搖動(dòng)，仔細(xì)混勻，這時(shí)溶液呈粉紅色，然后加水定容。待顏色穩(wěn)定時(shí)（20-30min），在波長570nm處測定各樣品的消光值。土壤的磷酸酶活性根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克數(shù)表示（若用P的毫克數(shù)表示，結(jié)果需乘；若用P2°5的毫克數(shù)表示，需乘）。標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別向100mL容量瓶中注入1,3,5,7,9,11mLT作液并顯色定容（分別相當(dāng)于，，，，，酚），待顏色穩(wěn)定后，比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5脫氫酶測定（比色法）取20g土壤于50ml三角瓶中，加碳酸鈣?；靹蚝蠹?ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%,在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（30C，相對濕度70%）培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，加25ml甲醇，振蕩5min，過濾。再用甲醇多次洗滌漏斗上的土壤，直至獲得無色濾液。合并濾液和洗液并定容50ml或1