種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)|食品生物技術(shù)/藥品生物技術(shù)|

陳珊時(shí)間：2021.5種子的擴(kuò)大培養(yǎng)工業(yè)菌種介紹除常見(jiàn)的四大類(lèi)典型微生物外，還有病毒，藻類(lèi)，以及蕈菌類(lèi)微生物。菌種選育方法自然界篩選，人工誘變，原生質(zhì)體融合，基因工程技術(shù)，蛋白質(zhì)工程等種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的和流程，種子擴(kuò)大培養(yǎng)的質(zhì)量影響因素影響種子擴(kuò)培因素包含的數(shù)量，質(zhì)量等要求種子的擴(kuò)大培養(yǎng)教程地位教學(xué)目標(biāo)學(xué)情分析教學(xué)重點(diǎn)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求

種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱(chēng)為種子。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體

活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長(zhǎng)

無(wú)雜菌污染種子的擴(kuò)大培養(yǎng)1.種子擴(kuò)大培養(yǎng)的一般流程保藏菌種斜面活化一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)…

發(fā)酵罐種子罐級(jí)數(shù)的確定2.種子擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程大致可分為兩個(gè)階段：實(shí)驗(yàn)室種子制備孢子制備液體種子制備好氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)生產(chǎn)車(chē)間種子制備種子罐的作用種子罐級(jí)數(shù)的確定確定種子罐級(jí)數(shù)注意點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種子的制備

實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)1，細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37℃。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為1-2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5-10天。2，霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25-28℃。培養(yǎng)時(shí)間一般為4-14天。3，放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無(wú)機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28℃。培養(yǎng)時(shí)間為5~14天。（一）孢子的制備種子的擴(kuò)大培養(yǎng)1，好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過(guò)程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備種子的擴(kuò)大培養(yǎng)1，好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過(guò)程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備種子的擴(kuò)大培養(yǎng)2，厭氧培養(yǎng)對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過(guò)程如下：試管→三角瓶→卡氏罐→種子罐例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制：3克麥芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克瓊脂與升水中）的斜面上，于4℃冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2-3天后，再擴(kuò)大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2天后，移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20℃培養(yǎng)3-5天即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時(shí)搖動(dòng)或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)車(chē)間種子的制備

實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時(shí)還需供給足夠的無(wú)菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。1，種子罐的作用：主要是使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)2，種子罐級(jí)數(shù)的確定種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（1）菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。比如：細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（27℃,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級(jí)種子罐（27℃，10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子種子的擴(kuò)大培養(yǎng)3，確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題（1）種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)（2）種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)（3）雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)三、種子質(zhì)量檢查與影響種子質(zhì)量的因素1.種子質(zhì)量檢查菌體量與菌體形態(tài)pH與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的變化產(chǎn)物生成量酶活力種子液的外觀與氣味2.種子質(zhì)量控制Ⅰ、影響孢子質(zhì)量的因素及控制

Ⅱ、影響種子質(zhì)量的因素及控制3.種子異常分析菌種生長(zhǎng)速度，過(guò)快或過(guò)慢；菌絲結(jié)團(tuán)；菌絲粘壁種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

1，培養(yǎng)基生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。

例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚(yú)胨或骨胨對(duì)孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中無(wú)機(jī)離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。Ⅰ、影響孢子質(zhì)量的因素及控制

影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類(lèi)型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類(lèi)型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用；（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)2，培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對(duì)多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。

如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37℃培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過(guò)早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。

例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長(zhǎng)得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長(zhǎng)得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長(zhǎng)得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。相對(duì)濕度（%）斜面外觀活孢子計(jì)數(shù)（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黃上部薄、中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.7不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長(zhǎng)的影響

（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)3，培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間（1）培養(yǎng)時(shí)間一般來(lái)說(shuō)，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過(guò)于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。（2）冷藏時(shí)間斜面冷藏對(duì)孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7-8天菌體細(xì)胞開(kāi)始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)4，接種量種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積

過(guò)大過(guò)小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。

接種量對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響楊博，中國(guó)油脂，2002采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產(chǎn)量。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)Ⅱ、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過(guò)程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。1，培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：（1）營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要（2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；（3）營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；（4）營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高（5）營(yíng)養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。

2，培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過(guò)程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

3，種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量還未達(dá)到最大值時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間較為合適。時(shí)間太長(zhǎng)，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過(guò)多種實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好。

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)4，接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。但接種量過(guò)大或者過(guò)小，均會(huì)影響發(fā)酵。過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過(guò)多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有時(shí)20-25%。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)Ⅲ、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無(wú)雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過(guò)程中通常進(jìn)行以下兩項(xiàng)檢查。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查（2）無(wú)（雜菌）檢查

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)四、種子制備過(guò)程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵(1)、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5，瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次種子的擴(kuò)大培養(yǎng)(2).一級(jí)種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml，32℃培養(yǎng)12h。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基本接近