第五章重組DNA技術(shù)

第五章分子生物學(xué)技術(shù)DNA重組技術(shù)及應(yīng)用第一頁，共三十五頁?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個世紀(jì)中葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。第二頁，共三十五頁?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。第三頁，共三十五頁。重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件三大成就：一、在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；第四頁，共三十五頁。三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。第五頁，共三十五頁。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點(diǎn)切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。第六頁，共三十五頁。圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端。第七頁，共三十五頁。第八頁，共三十五頁。（二）基因克隆的載體

我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基因工程的要求，因為大多數(shù)DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，只有將他們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。載體（vector)是指具備自主復(fù)制的DNA分子，象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對分子量較小的復(fù)制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。第九頁，共三十五頁。載體三要素：自我復(fù)制能力；攜帶外源基因片段大小（具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)）；插入位點(diǎn)多少（具有若干限制酶單一識別位點(diǎn)）；易于鑒定識別（具有抗菌素抗性基因）第十頁，共三十五頁。大腸桿菌質(zhì)粒載體:1、pSC101質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細(xì)胞僅有1~2個拷貝。長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個位點(diǎn)插入外源基因，會導(dǎo)致tetr失活。第十一頁，共三十五頁。

大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體示意圖。第十二頁，共三十五頁。是第一個真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，產(chǎn)量很低。第十三頁，共三十五頁。2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長也隨之停止。而松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時，使每個寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到1000~3000個，占細(xì)胞總DNA的50%左右。第十四頁，共三十五頁。3、pBR322質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。第十五頁，共三十五頁。AmpR第十六頁，共三十五頁。優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量，其長度為4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，每個細(xì)胞中可累積1000~3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。第十七頁，共三十五頁。4、pUC質(zhì)粒載體（包括四個部分）：(i)來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ’基因；(iv)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ’基因的功能。第十八頁，共三十五頁。優(yōu)點(diǎn)：更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素擴(kuò)增時，平均每個細(xì)胞即可達(dá)500~700個拷貝。第十九頁，共三十五頁?？捎媒M織化學(xué)方法檢測重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ‘基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用。因此，可用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。第二十頁，共三十五頁。5、

pGEM-3Z質(zhì)粒長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ'基因。含有兩個噬菌體啟動子（T7和SP6），為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點(diǎn)。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。第二十一頁，共三十五頁。6、穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，具有廣泛的用途。第二十二頁，共三十五頁。7、pBluescript噬菌粒載體pBluescript是指由Stratagene公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。第二十三頁，共三十五頁。第二十四頁，共三十五頁。SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點(diǎn)則表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA。第二十五頁，共三十五頁。(i)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；(ii)具有單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個來自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；第二十六頁，共三十五頁。(iii）編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；(iv)含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。第二十七頁，共三十五頁。LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)該基因表達(dá)，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶相互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色。第二十八頁，共三十五頁。重組DNA操作過程示意圖第二十九頁，共三十五頁。圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體

第三十頁，共三十五頁。僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。第三十一頁，共三十五頁。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。第三十二頁，共三十五頁。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖（圖5-3）。

第三十三頁，共三十五頁。圖5-3重組DNA操作過程示意圖

第三十四頁，共三十五頁。內(nèi)容總結(jié)第五章