優(yōu)化高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留情況,食品安全論文

優(yōu)化高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留情況,食品安全論文諾氟沙星(NOＲ)、恩諾沙星(ENＲ)、環(huán)丙沙星(CIP)、達(dá)氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SAＲ)為常見的氟喹諾酮類抗菌劑，當(dāng)前在畜禽生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用．此類藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致的藥物殘留可能直接危害人體健康，可以能使致病菌產(chǎn)生耐藥性，間接對(duì)人類健康造成影響．多個(gè)國家和地區(qū)均規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量．檢測動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方式方法有微生物法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、電解分析法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等．當(dāng)前，在雞肉產(chǎn)品的檢測中，常采用的方式方法是(動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測－高效液相色譜法〕(農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008)．本試驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，簡化了試驗(yàn)前處理方式方法，優(yōu)化了檢測經(jīng)過．經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該法非常合適大批量處理樣品，大量節(jié)省了處理時(shí)間和所需耗材，較大幅度降低成本，方式方法的靈敏度和回收率均可知足我們國家現(xiàn)行獸藥殘留檢測分析的要求．1材料與方式方法1．1藥品和試劑恩諾沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品、諾氟沙星對(duì)照品、達(dá)氟沙星對(duì)照品、沙拉沙星對(duì)照品，均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品，磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉溶液(分析純，廣州試劑廠)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)．1．2儀器和設(shè)備Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司)配熒光檢測器，高速勻質(zhì)機(jī)及振蕩器(德國IKA公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)．1．3試液配制分別稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星對(duì)照品各10mg，置于同一個(gè)10mL容量瓶中，用0.05molL－1的氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，制得質(zhì)量濃度均為1mgmL－1的混合儲(chǔ)備溶液．準(zhǔn)確稱取達(dá)氟沙星對(duì)照品10mg，0.05molL－1的氫氧化鈉溶液溶解定容至10mL，使其質(zhì)量濃度為1mgmL－1．準(zhǔn)確稱取沙拉沙星對(duì)照品10mg，0.05molL－1的氫氧化鈉溶液溶解定容至10mL，使其質(zhì)量濃度為1mgmL－1．置2～8℃冰箱中保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月．取上述恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的混和儲(chǔ)備液100L，達(dá)氟沙星儲(chǔ)備液20L，沙拉沙星儲(chǔ)備液200L，置于同一個(gè)100mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，配置成恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的質(zhì)量濃度為1gmL－1，達(dá)氟沙星質(zhì)量濃度為0.2gmL－1，沙拉沙星質(zhì)量濃度為2gmL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液．提取液:稱取2g三氯乙酸于容量瓶中，加水至100mL，制得的三氯乙酸溶液與乙腈按體積比3∶1的比例混合，攪拌均勻，得到提取液．磷酸/三乙胺溶液:取磷酸3.4mL，用水稀釋至1000mL，配成0.02molL－1的磷酸溶液，用三乙胺調(diào)pH至2.4．臨用配制(易產(chǎn)生沉淀)．1．4測定方式方法1．4．1供試材料的制備將市售的雞肉樣品用高速勻漿機(jī)絞碎得到供試試料，將空白雞肉樣品絞碎得到空白試料，在空白試料中添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料．1．4．2提取與凈化稱取1g試料，置于勻漿杯中，加提取液4mL，高速勻漿1min．勻漿液轉(zhuǎn)入15mL聚丙烯離心管中，振蕩30min，16000r/min，離心8min，取上清液過0.2m濾膜，裝入進(jìn)樣瓶，待測．1．4．3色譜條件色譜柱:AgilentTC-C18250mm4.6mm(i．d)，粒徑5m．流動(dòng)相:V(0.02molL－1磷酸/三乙胺溶液)∶V(乙腈)=80∶20．流速:1mLmin－1．檢測波長:激發(fā)波長280nm;發(fā)射波長450nm．進(jìn)樣量:20L．1．5線性范圍與檢出限空白樣品中參加混合標(biāo)準(zhǔn)液配制成的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液．高效液相色譜儀檢測后，以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析．在空白樣品中添加不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4的方式方法進(jìn)行處理，檢測后取信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方式方法檢出限(LOD)，信噪比S/N=10對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方式方法定量限(LOQ)．1．6回收率和精致細(xì)密度向空白待測樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按1.4的方式方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度重復(fù)5次，連續(xù)做3個(gè)批次，計(jì)算回收率和變異系數(shù)．2結(jié)果與分析2．1色譜分析在試驗(yàn)選定的條件下，測得諾氟沙星的保存時(shí)間為6.67min，環(huán)丙沙星為7.19min，達(dá)氟沙星為8.18min，恩諾沙星為9.07min，沙拉沙星為12.93min，峰形尖銳，分離完全，空白組織樣品在上述保存時(shí)間無干擾峰出現(xiàn)(圖1)．2．2方式方法的檢出限及標(biāo)準(zhǔn)曲線空白雞肉樣品中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留定量限為10gkg－1，達(dá)氟沙星的殘留定量限為2gkg－1，沙拉沙星的殘留定量限為20gkg－1．諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的線性范圍為10～100gkg－1，達(dá)氟沙星為2～20gkg－1，沙拉沙星為20～200gkg－1．對(duì)質(zhì)量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行色譜分析，工作曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1．可見，本方式方法靈敏度高、線性范圍較寬，有一定的實(shí)用價(jià)值．【表1】2．3方式方法的回收率與精致細(xì)密度對(duì)雞肉樣品分別進(jìn)行4個(gè)濃度的添加試驗(yàn)，測得的回收率為84.71%～99.66%，批內(nèi)變異系數(shù)為0．20%～4.42%，批間變異系數(shù)為0.33%～2.68%(表2)．2．4抽樣檢測從市場上購買30個(gè)雞肉樣品，每份樣品2個(gè)重復(fù)，按本方式方法進(jìn)行制樣和檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一例雞肉樣品中諾氟沙星殘留量為43.5gkg－1，平行樣品中諾氟沙星的質(zhì)量濃度為41.4gkg－1，其余樣品均未檢出氟喹諾酮藥物的殘留．表示清楚該方式方法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的重現(xiàn)性非常好，相對(duì)偏差保持在3%之內(nèi)，數(shù)據(jù)可靠．3討論與結(jié)論3．1樣品前處理方式方法的優(yōu)化動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，選擇并優(yōu)化樣品的前處理方式方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要．本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14-2008所采用方式方法的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理經(jīng)過進(jìn)行了一定的優(yōu)化．該標(biāo)準(zhǔn)檢測方式方法采用磷酸鹽緩沖液提取完后，離心取上清液，過固相萃取柱，進(jìn)而除去樣品中的雜質(zhì)．本試驗(yàn)的提取液由乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的三氯乙酸按體積比1∶3混合而配得，蛋白質(zhì)在酸性條件下變性，離心出沉淀除掉雜質(zhì)，而提取液中參加乙腈也與流動(dòng)相中乙腈比例吻合，出峰較好．比擬其他相關(guān)研究，仲鋒在雞組織中檢測氟喹諾酮類藥物殘留量的回收率為70%～107%，變異系數(shù)小于10%;陳紅等在雞排泄物中檢測氟喹諾酮類藥物的回收率為75%以上，批內(nèi)變異系數(shù)在2.2%～10%之間，批間變異系數(shù)在6.2%～13.0%之間;而本試驗(yàn)測得的回收率為84.71%～99.66%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.20%～4.42%，批間變異系數(shù)為0.33%～2.68%．相較而言，本試驗(yàn)的回收率有了明顯穩(wěn)定的提高，精致細(xì)密度和準(zhǔn)確度也相應(yīng)改善了，定量限能知足日常采集樣品的檢測范圍，而且檢測的效率大大增加，節(jié)省了柱子的成本，減少了處理的時(shí)間，非常適用于樣本量較大時(shí)的殘留檢測．3．2檢測方式方法的穩(wěn)定性將新鮮配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50gkg－1于4℃冰箱中避光保存1、3、5、7d后上機(jī)檢測，結(jié)果表示清楚，被測藥物保存時(shí)間基本不變，但濃度明顯降低，可見標(biāo)液在保存經(jīng)過中不穩(wěn)定，因而在測定經(jīng)過中應(yīng)該做到現(xiàn)用現(xiàn)配，處理完后的樣品也應(yīng)及時(shí)上機(jī)．3．3結(jié)論本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14-2008所采用方式方法的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理經(jīng)過進(jìn)行了優(yōu)化，使樣品處理快速便利，靈敏度高，重現(xiàn)性好，明顯降低批量樣品的檢測成本，可有效應(yīng)用于雞肉食品品質(zhì)的日常監(jiān)控．以下為參考文獻(xiàn):［1］李俊鎖，邱月明，王超．獸藥殘留分析［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002:365-390．［2］WIN