有關(guān)基因工程的論文優(yōu)秀范文參考,基因工程論文

有關(guān)基因工程的論文優(yōu)秀范文參考,基因工程論文基因工程是以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的當(dāng)代方式方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。本文提供幾篇有關(guān)基因工程的論文優(yōu)秀范文，供大家學(xué)習(xí)。有關(guān)基因工程的論文一：(重組人纖維蛋白原基因在畢赤酵母中的高效表示出〕［內(nèi)容摘要］目的構(gòu)建含有人纖維蛋白原基因的畢赤酵母表示出系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)胞外高效分泌表示出。方式方法全基因合成人纖維蛋白原3個(gè)基因FGA、FGB、FGG，構(gòu)建表示出載體pGAPZA-FGB-FGG-FGA-AOX1，線性化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株SMD1168H，抗性挑選獲得陽性克隆。發(fā)酵液經(jīng)SDS確定蛋白表示出部位，ELISA檢測目的蛋白表示出量。表示出產(chǎn)物超濾濃縮后利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，Westernblot檢測蛋白表示出情況并對純化產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性測定。結(jié)果基因工程菌株搖瓶培養(yǎng)上清液表示出量約15mg/L，生物學(xué)活性分析重組蛋白具有凝集活性。結(jié)論成功獲得了高效分泌表示出重組人纖維蛋白原的畢赤酵母菌株，且分離純化的蛋白具有生物凝集活性。［本文關(guān)鍵詞語］重組人纖維蛋白原;畢赤酵母;分泌表示出;分離純化當(dāng)前世界衛(wèi)生組織確認(rèn)的凝血因子共13個(gè)，大多由肝臟產(chǎn)生，正常情況下，所有凝血因子都處于無活性狀態(tài)，以無活性酶原形式存在，當(dāng)某一凝血因子被激活后，可使很多凝血因子按一定的次序先后被激活，逐級放大，直到纖維蛋白構(gòu)成，血液發(fā)生凝固。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)，即凝血因子，是介入血液凝固的重要凝血因子，血漿中含量高達(dá)2000～4000mg/L［1］，其分子量340kDa，由完全一樣的2個(gè)亞基組成共價(jià)二聚體，每個(gè)亞基含有(63.5kDa)、(56kDa)、(47kDa)3條肽鏈［2］，分別由4號染號體(4q28-30)上的3個(gè)獨(dú)立的基因FGA、FGB、FGG編碼構(gòu)成，在肝臟中由獨(dú)立的核糖體合成其前體蛋白，再經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體完成蛋白的組裝，各肽鏈相互通過二硫鍵互相連接構(gòu)成Fg單體。2個(gè)單體通過3對鏈間二硫鍵連接構(gòu)成對稱性二聚體，即Fg。纖維蛋白原介入凝血經(jīng)過的機(jī)理:當(dāng)血液中的凝血酶原被激活時(shí)，凝血酶作用于纖維蛋白原，切斷纖維蛋白原鏈N末端區(qū)域和鏈N末端區(qū)域，鏈的解離有利于纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)呈線性增長，鏈的解離有利于纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)呈側(cè)向增長，最終纖維蛋白單體以錯(cuò)綜重疊狀態(tài)側(cè)向聚合締結(jié)為網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的血凝塊［3］。凝血初期非共價(jià)鍵結(jié)合可溶性的血凝塊，然后在體內(nèi)凝血因子ⅩⅢ(谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，又稱纖維蛋白穩(wěn)定因子)和Ca2+作用下，纖維蛋白單體通過ε-氨基--谷氨?；B接，構(gòu)成不溶性的穩(wěn)定血凝塊［4］，進(jìn)而發(fā)揮凝血和生理性止血功能。另外，纖維蛋白原還介入體內(nèi)血小板聚集、纖溶調(diào)節(jié)、動脈硬化的發(fā)生發(fā)展、組織損傷及修復(fù)等一系列病理和生理經(jīng)過［5-8］。醫(yī)藥級纖維蛋白原提取于人體血液，生產(chǎn)成本高昂且難以避免血源性傳染病(如乙肝和艾滋病等)的傳播風(fēng)險(xiǎn)，影響其市場應(yīng)用及推廣。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，采用基因工程方式方法高效表示出安全、可靠的人纖維蛋白原成為研究熱門。2018年，黃星等［9］將人纖維蛋白原基因在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表示出，發(fā)現(xiàn)人纖維蛋白原3個(gè)亞基不能共表示出，即纖維蛋白原的、鏈能用pET系列載體獲得表示出，而鏈卻沒有能獲得表示出。大腸桿菌等原核生物表示出系統(tǒng)還存在目的蛋白無法正確折疊修飾等空間構(gòu)造問題，影響纖維蛋白原生物活性。動物細(xì)胞表示出系統(tǒng)中，固然能夠通過哺乳動物乳腺生物反響器獲得特異性表示出具活性的纖維蛋白原，但存在投入成本高、基因打靶的位置效應(yīng)導(dǎo)致基因整合具隨機(jī)性、重組蛋白與天然蛋白修飾加工仍存在差異等問題，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)［10-11］。酵母表示出系統(tǒng)能夠克制大腸桿菌和動物細(xì)胞表示出系統(tǒng)的缺乏，通過高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工功能愈加完善，蛋白產(chǎn)物更接近天然蛋白質(zhì)功能。本研究擬通過構(gòu)建重組人纖維蛋白原酵母表示出載體獲得高效分泌表示出的畢赤酵母菌株，分離純化具生物活性蛋白，為進(jìn)一步開發(fā)有效的藥用纖維蛋白原奠定基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1、材料1.1.1、質(zhì)粒與菌株:質(zhì)粒pGAPZA(Invitrogen)，含有GAP啟動子和Zeocin抗性基因，作為表示出載體;質(zhì)粒pPIC9K，僅用于AOX1基因的PCR擴(kuò)增，并將該基因連接入pGAPZA表示出載體，利用AOX1作為線性化位點(diǎn)進(jìn)行同源重組，以上質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株以畢赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168H作為表示出宿主，為本實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2培養(yǎng)基:低鹽LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，pH7.5;YPD培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂粉。1.1.3、試劑:限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購自NEB公司、Taq酶、DNAMarker、蛋白分子量Marker等購自Fermentas公司，抗生素Zeocin購自Invitrogen公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，超濾管購自Millipore公司，層析柱填料SephacrylTMS-100HR購自GE公司，ELISA試劑盒購自Bio-Swamp公司，鼠抗人單克隆抗體(、、)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG均購自SantaCruz公司，DAB顯色試劑盒購自Tiangen公司。其他試劑均為市售分析純。1.1.4、儀器:搖床(伊孚森生物技術(shù)中國有限公司)、PCR儀(Eppendorf)、離心機(jī)(Thermo)、電轉(zhuǎn)化儀(Biorad)、酶標(biāo)儀(Tecan)、蛋白電泳設(shè)備(Biorad)、AKTA蛋白分離純化儀(AKTAExplorer)、生物樣品均質(zhì)器(Bertin)。1.2、方式方法1.2.1、pGAPZA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質(zhì)粒的構(gòu)建NCBI數(shù)據(jù)庫檢索人纖維蛋白原FGA、FGB、FGG基因序列(GeneID分別為2243、2244、2266)，根據(jù)宿主菌株畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化，并設(shè)計(jì)適宜的酶切位點(diǎn)，對含GAP啟動子和AOX1TT終止子表示出框的全基因序列合成，重組質(zhì)粒載體如此圖1所示，詳細(xì)步驟如下:圖1重組人纖維蛋白原酵母表示出載體的構(gòu)建圖①限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ分別雙酶切FGB基因和pGAPZA質(zhì)粒，經(jīng)純化連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，于25g/mLZeocin低鹽LB固體培養(yǎng)基挑選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得pGAPZA-FGB重組質(zhì)粒。②限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別單酶切FGG基因和pGAPZA-FGB質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，抗性挑選獲得pGAPZA-FGB-FGG重組質(zhì)粒。③限制性內(nèi)切酶NdeⅠ分別單酶切FGA基因和pGAPZA-FGB-FGG質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，抗性挑選獲得pGAPZA-FGB-FGG-FGA重組質(zhì)粒。④以pPIC9K質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增AOX1基因，PstⅠ單酶切AOX1基因和pGAPZA-FGB-FGG-FGA重組質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，抗性挑選獲得pGAPZA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質(zhì)粒。每一步重組質(zhì)粒構(gòu)建均經(jīng)生物公司測序正確后，再進(jìn)行下一個(gè)目的片段的連接。1.2.2、畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及PCR擴(kuò)增驗(yàn)證:PmeⅠ單酶切線性化重組質(zhì)粒pGAPZA-FGB-FGG-FGA-AOX1，膠回收純化，按(畢赤酵母表示出操作手冊〕［12］方式方法電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168H感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件:1.5kV，200，25F。電轉(zhuǎn)化后酵母細(xì)胞涂布于含1g/mLZeocin抗性平板，28℃培養(yǎng)2d，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，以破壁重組子為模板，PCR擴(kuò)增檢測重組載體的FGA、FGB、FGG基因驗(yàn)證。1.2.3、重組人纖維蛋白原的表示出:挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基(含1g/mLZeocin)，28℃，220r/min培養(yǎng)60h。采用生物樣品均質(zhì)器對發(fā)酵液及菌體破碎，均質(zhì)速度6500r/min，3個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)運(yùn)行時(shí)間為30s，循環(huán)間隔30s。參考(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南〕［13］對全細(xì)胞破碎液、菌體沉淀破碎液及發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS電泳檢測，確定目的蛋白的表示出部位，ELISA試劑盒檢測確定目的蛋白的表示出量。1.2.4、重組人纖維蛋白原的Westernblot檢測:發(fā)酵上清液經(jīng)30kDa超濾管濃縮，AKTA純化系統(tǒng)分離，收集蛋白吸收峰值處洗脫液進(jìn)行二次超濾濃縮獲得純化蛋白。純化條件:分子篩層析柱ColumnXK16，凝膠填料為SephacrylTMS-100HR，流速0.5mL/min，上樣量5mL。純化蛋白分別以小鼠單克隆一抗(、、)(稀釋比例1∶1000)，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗(稀釋比例1∶10000)進(jìn)行Westernblot，抗體孵育結(jié)束后洗膜3次，