實(shí)驗(yàn)四蛋白酶活力的測定

關(guān)于實(shí)驗(yàn)四蛋白酶活力的測定第1頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆斩繙y定蛋白酶活性的方法，了解本實(shí)驗(yàn)的酶、底物和生成物的相關(guān)性，以及本反應(yīng)的環(huán)境條件。進(jìn)一步理解酶活力和比活力的概念鞏固比色法測定物質(zhì)含量的基礎(chǔ)，掌握分光光度計(jì)使用方法，學(xué)習(xí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法第2頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理1．胰蛋白酶是一種水解酶，將酪蛋白水解成酪氨酸等物質(zhì)。2．所生成的酪氨酸能與酚試劑反應(yīng)成藍(lán)色物質(zhì)。酚試劑又名Folin試劑，是磷鎢酸和磷鉬酸的混合物，在堿性條件下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物還原產(chǎn)生藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物，680nm）。3．用分光光度計(jì)可以定量比較顏色深淺，測定酪氨酸生成量，根據(jù)生成物的含量可以計(jì)算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。4.蛋白酶活力單位定義：在40C，pH7.5的條件下，反應(yīng)10min，以每min水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸為1U。第3頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月三、器材儀器和主要試劑

可見光分光光度計(jì)水浴鍋Folin–酚試劑0.5%酪蛋白100g/mlTyr溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶

第4頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)操作1、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)123456樣品、對照濾液（各2支試管）100g/mlTyr(ml)00.20.40.60.81.0每支管加1ml水（ml)1.00.80.60.40.20稀釋后Tyr濃度（μg/ml）020406080100Na2CO3(ml)5555555Folin-酚試劑(ml)1111111迅速混合，于40℃放置15分鐘

A680nm調(diào)0

A樣、A對照以酪氨酸的濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40℃水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40℃水浴保溫10分鐘，過濾得濾液

樣品管12----3-------對照管1----3------2第5頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月2、蛋白酶活力的測定按下表操作，然后測定濾液中的酪氨酸含量。濾液各取1ml，進(jìn)行顯色反應(yīng)(加Na2CO35ml+Folin-酚試劑1ml，40C保溫15min)以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的1號(hào)管調(diào)0，測定A樣(樣品液A680nm值)和A對(對照液A680nm值)；管號(hào)酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40℃水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40℃水浴保溫10分鐘，過濾得濾液。

1′

號(hào)(樣品)12----3-------2′號(hào)(對照)1----3------2第6頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月3.酶活力計(jì)算胰酶活力定義：

40℃，pH7.5，反應(yīng)10min，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸1微克為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算：1g蛋白酶所具備的總活力單位為：(

A樣-A對)×K×V/t×NA樣：樣品液光吸收值；A對：對照液光吸收值；K：標(biāo)準(zhǔn)曲線上A680nm為1時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；t：酶促反應(yīng)的時(shí)間（min），本實(shí)驗(yàn)t=10min；V：酶促反應(yīng)管的總體積（ml數(shù)），本實(shí)驗(yàn)V=6；N：本次實(shí)驗(yàn)酶液的稀釋倍數(shù):6000第7頁，課件共9頁，創(chuàng)作于2023年2月五、思考題酶的試驗(yàn)為何設(shè)對照又要設(shè)空白?稀釋的酶溶液是否可長期使用？說明原因。計(jì)算公式中的v=6該如何理解本實(shí)驗(yàn)用什么方法終止酶促反應(yīng)?