3生物化學試驗

微生物檢驗技術

----生物化學試驗問題導入

細菌的鑒定方法有很多，包括：形態(tài)學檢查、生化反應、血清學試驗、動物試驗及其他方法。生化反應涵蓋眾多，這堂課將做介紹。1.熟悉常見生物化學試驗的操作方法2.掌握各種常見生物化學試驗的結果判斷及意義3.熟悉細菌常見生物化學試驗的種類學習目標

糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗

1碳水化合物代謝試驗葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

2甲基紅試驗

3

V-P試驗

4

β-半乳糖苷酶試驗

5七葉苷水解試驗

6學習目錄-1蛋白質類代謝試驗靛基質試驗

7硫化氫試驗

8尿素酶試驗

9苯丙氨酸脫氨酶試驗

10氨基酸脫羧酶試驗

11學習目錄-2

有機鹽類試驗枸櫞酸鹽利用試驗

12丙二酸鹽利用試驗

13學習目錄-3

酶類試驗

觸酶（過氧化氫酶）試驗

14氧化酶試驗

15血漿凝固酶試驗

16硝酸鹽還原試驗

17膽汁溶菌試驗

18CAMP試驗

19學習目錄-4克氏雙糖鐵（KIA）試驗

20其他生化試驗學習目錄-5糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗11-1糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的目的根據(jù)細菌是否具有發(fā)酵糖（苷、醇）類物質的酶，來對細菌進行鑒定。是鑒定細菌最主要的試驗之一，對于腸道桿菌科細菌的鑒定尤為重要。-:陰性+：陽性產(chǎn)酸：陽性產(chǎn)酸產(chǎn)氣多糖→單糖→丙酮酸→酸性產(chǎn)物(或產(chǎn)酸產(chǎn)氣)→PH↓→指示劑呈酸性變色(若產(chǎn)氣者有氣泡出現(xiàn))。1-2糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的原理方法:

將純種細菌以無菌操作接種到含有指示劑的培養(yǎng)基中，置35℃溫箱培養(yǎng)數(shù)小時至兩周，觀察結果。應用：主要用于腸桿菌科的鑒定。1-3糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的方法與應用培養(yǎng)基培養(yǎng)基內除常用營養(yǎng)成分還有糖（苷、醇）類物質和指示劑，常用指示劑為溴甲酚紫，它的存在使培養(yǎng)基呈紫色。若細菌分解糖（苷、醇）產(chǎn)酸，在酸性環(huán)境中，溴甲酚紫變黃色。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。1-3糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的過程試驗過程將待檢細菌以無菌操作接種到含有指示劑的糖（苷、醇）類發(fā)酵培養(yǎng)基中，置35℃恒溫箱培養(yǎng)18~24h后，觀察結果。1-4糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的結果判斷+陰性-：培養(yǎng)基不變色，無氣泡出現(xiàn)。細菌不分解糖（苷、醇）類物質。結果判斷1-4糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的結果判斷+陽性產(chǎn)酸+：培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。細菌分解糖（苷、醇）類物質產(chǎn)酸。結果判斷1-4糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗的結果判斷+陽性產(chǎn)酸產(chǎn)氣：培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，并且有氣泡出現(xiàn)。細菌分解糖（苷、醇）類物質產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。結果判斷葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗22-1葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的目的根據(jù)細菌在分解葡萄糖時對氧的需求不同，來對細菌進行鑒定。利用此試驗可區(qū)別細菌的代謝類型。主要用于腸桿菌和非發(fā)酵菌的鑒別，也可用于葡萄球菌和微球菌的鑒別。2-2葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的原理細菌分解葡萄糖對O2需求不同，氧化型細菌只在有氧環(huán)境中分解葡萄糖產(chǎn)酸，發(fā)酵型細菌可在有氧、無氧環(huán)境中分解葡萄糖產(chǎn)酸，產(chǎn)堿型細菌在有氧、無氧環(huán)境中都不分解葡萄糖。方法:取2支HL葡萄糖培養(yǎng)管煮沸驅氧，待冷后接種菌種。一管管口敞開，一管用液體石蠟封管，培養(yǎng)18~24h觀察結果。應用:主要用于革蘭陰性桿菌的鑒別。2-3葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的方法與應用培養(yǎng)基HL葡萄糖培養(yǎng)基：培養(yǎng)基內除常用營養(yǎng)成分外還有葡萄糖和指示劑，常用指示劑為溴麝香草酚藍，它的存在使培養(yǎng)基呈綠色。若細菌產(chǎn)酸，在酸性環(huán)境中，溴麝香草酚藍呈黃色。2-3葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的過程試驗過程取2支HL葡萄糖培養(yǎng)基煮沸驅氧，待冷后接種細菌。一管內加液體石蠟封管設為閉管，另一管不加，為開放管，置于35℃恒溫箱培養(yǎng)18~24h觀察開閉管變色情況。2-4葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的結果判斷+氧化型O：開管由綠色變?yōu)辄S色，閉管不變色。說明該細菌為氧化型細菌。結果判斷2-4葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的結果判斷+發(fā)酵型F：開管由綠色變?yōu)辄S色，閉管由綠色變?yōu)辄S色。說明該細菌為發(fā)酵型細菌。結果判斷2-4葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗的結果判斷+產(chǎn)堿型-：開管不變色，閉管不變色。說明該細菌為產(chǎn)堿型細菌。結果判斷甲基紅試驗3細菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖→丙酮酸→大量混合酸→培養(yǎng)基pH<4.4→加入甲基紅試劑→培養(yǎng)基變紅/若細菌產(chǎn)酸量少或酸進一步分解為其他物質（如醇、醛、酮、氣體等）→培養(yǎng)基pH>5.4→加入甲基紅試劑→培養(yǎng)基變黃。3-1甲基紅試驗的原理將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水中,35℃培養(yǎng)6～18小時后,往培養(yǎng)基中加入甲基紅指示劑少許,觀察結果。3-2甲基紅試驗的方法3-2甲基紅試驗的結果判斷空白對照陰性陽性甲基紅試驗結果（源于試驗原理）實操結果

陰性陽性3-2

甲基紅試驗的結果判斷與應用結果判定：呈現(xiàn)紅色，MR試驗陽性；呈現(xiàn)黃色，MR試驗陰性。應用：主要用于鑒別大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。此外，腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、變形桿菌屬等為陽性，而腸桿菌屬則為陰性。V-P試驗4某些細菌分解糖類→丙酮酸→繼續(xù)脫羧→乙酰甲基甲醇→KOH(試劑甲）+空氣氧化→雙乙酰+α-萘酚、肌酸（試劑乙）→紅色化合物。4-1V-P試驗的原理將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48h后按每毫升培養(yǎng)基加入VP試劑甲和試劑乙,數(shù)分鐘或數(shù)小時后觀察結果。4-2V-P試驗的方法4-3V-P試驗的結果判斷陽性陰性V-P試驗結果（源于試驗原理）實操結果

陽性陰性4-3V-P試驗的結果判斷與應用結果判定：呈現(xiàn)紅色，V-P試驗陽性；呈現(xiàn)黃色或類似銅色，V-P試驗陰性。應用：主要用于鑒別大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌。本實驗常與甲基紅試驗聯(lián)合使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。β-半乳糖苷酶試驗5

能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細菌，可以分解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)，從而生成黃色的鄰硝基苯酚。5-1

β-半乳糖苷酶試驗（ONPG）的原理

將待檢菌種接種于1%乳糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)18～24小時。用接種環(huán)取新鮮細菌一環(huán)，加入到0.25ml的無菌生理鹽水中，加甲苯1滴充分振動，37℃水浴5min，再加入0.25ml無色ONPG溶液，置37℃水浴，觀察結果。

5-2

β-半乳糖苷酶試驗（ONPG）的方法

5-3

β-半乳糖苷酶試驗（ONPG）的結果判斷β-半乳糖苷酶試驗結果（源于試驗原理）實操結果陰性

陽性

5-3

β-半乳糖苷酶試驗（ONPG）的結果判斷與應用結果判定：呈現(xiàn)黃色，β-半乳糖苷酶試驗陽性；呈現(xiàn)無色，β-半乳糖苷酶試驗陰性。應用：主要用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定。本試驗對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬等則為陰性。七葉苷水解試驗6七葉苷可以被細菌分解為葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的Fe2+反應，形成黑色化合物，使培養(yǎng)基變黑。

6-1七葉苷水解試驗的原理

將待檢菌種接種于七葉苷培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)18～24小時，觀察結果。

6-2七葉苷水解試驗的方法

6-3

七葉苷水解試驗的結果判斷陽性陰性七葉苷水解試驗結果（源于試驗原理）實操結果

陽性陰性

6-4

七葉苷水解試驗的結果判斷與應用結果判定：培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色，七葉苷水解試驗陽性；培養(yǎng)基不變色，

七葉苷水解試驗陰性。應用：主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。亦可用于腸桿菌科細菌、其他革蘭陰性菌及厭氧菌的鑒別。靛基質試驗7

7-1

吲哚（靛基質）試驗的原理

某些細菌具有色氨酸酶，分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸生成靛基質（吲哚），當加入吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛）后，形成紅色的玫瑰吲哚。

7-2

吲哚（靛基質）試驗的方法

將待檢菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24小時，取出后沿試管壁緩慢加入靛基質試劑（對二甲氨基苯甲醛）數(shù)滴，在兩液面接觸處觀察結果。

7-3

吲哚（靛基質）試驗的結果判斷

無菌管陰性陽性靛基質試驗結果（源于試驗原理）實操結果

陰性陽性

7-3

吲哚（靛基質）試驗的結果判斷與應用結果判定：試劑與培養(yǎng)基液面交界處呈現(xiàn)紅色，靛基質試驗陽性；呈現(xiàn)無色，靛基質試驗陰性。應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。其中，大腸埃希菌多為陽性，沙門菌屬為陰性。硫化氫試驗8

8-1硫化氫試驗的原理與方法

原理：某些細菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S，H2S與培養(yǎng)基中的Fe2+或Pb2+發(fā)生反應，生成黑色的硫化亞鐵或硫化鉛沉淀。方法：將細菌穿刺接種到醋酸鉛培養(yǎng)基中，35℃、24～48h，觀察結果。

8-2硫化氫試驗的結果判斷

陽性陰性硫化氫試驗結果（源于試驗原理）實操結果無菌管陽性陽性陰性

8-2硫化氫試驗的結果判斷與應用結果判定：培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色，硫化氫試驗陽性；培養(yǎng)基顏色無變化，硫化氫試驗陰性。應用：主要用于腸桿菌科菌屬間的鑒定。如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬的細菌，大多數(shù)硫化氫試驗陽性，其他菌屬陰性。但沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。尿素酶試驗99-1尿素酶試驗的原理產(chǎn)生尿素酶的細菌，能分解尿素產(chǎn)生氨和CO2，氨在溶液中形成碳酸銨，使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑變紅。方法：

將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h取出觀察。

尿素酶試驗的方法、結果判斷與應用結果:

培養(yǎng)基變紅：+

培養(yǎng)基不變色：－應用：腸桿菌科屬間鑒別。對照陽性陰性9-2苯丙氨酸脫氨酶試驗10

有苯丙氨酸脫氨酶的細菌，可以使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙銅酸與三氯化鐵作用形成綠色化合物。10-1

苯丙氨酸脫氨酶試驗的原理瓊脂斜面法：將待檢細菌接種到苯丙氨酸瓊脂斜面上，35℃培養(yǎng)24～48h，取出，將三氯化鐵試劑4～5滴滴于斜面上，觀察結果?？焖偌埰ǎ簩⒋龣z菌涂于苯丙氨酸紙片上，孵育15min，取出，滴加三氯化鐵試劑，立即觀察結果。

10-2

苯丙氨酸脫氨酶試驗的方法加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色（+）10-3

苯丙氨酸脫氨酶試驗的結果判斷與應用結果：

綠色陽性

黃色陰性應用：多用于腸桿菌科的鑒定。變形桿菌屬、摩根菌屬、普羅菲登斯菌屬均為陽性，腸桿菌科其他細菌為陰性。+-氨基酸脫羧酶試驗1111-1

氨基酸脫羧酶試驗的原理

某些細菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，可分解氨基酸使其脫去羧基，生成胺類物質和CO2。胺類物質使培養(yǎng)基呈堿性反應，使指示劑（溴甲酚紫）變紫色，為陽性；如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。11-2

氨基酸脫羧酶試驗的方法取待測菌分別接種于氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基（含葡萄糖、賴氨酸或鳥氨酸或精氨酸，指示劑為溴甲酚紫）和氨基酸對照培養(yǎng)基（不加氨基酸），并加入無菌液體石蠟，35℃培養(yǎng)18-24小時觀察結果。11-3

氨基酸脫羧酶試驗的結果判斷結果：

對照管應呈黃色，測定管呈紫色為陽性，測定管呈黃色為陰性；若對照管呈紫色則試驗無意義。變紫色呈黃色試驗管對照管（+）呈黃色呈黃色試驗管對照管（-）

氨基酸脫羧酶試驗的結果判斷11-3

氨基酸脫羧酶試驗的應用

賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸脫羧酶試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。11-4枸櫞酸鹽利用試驗12能利用枸櫞酸鹽的細菌，也能利用銨鹽作為唯一的碳源，分解后生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍由淺綠色變?yōu)樯钏{色。12-1

枸櫞酸鹽利用試驗的原理枸櫞酸鹽銨鹽碳酸鹽氨培養(yǎng)基pH上升溴麝香草酚藍（指示劑）呈堿性變色培養(yǎng)基變藍培養(yǎng)基12-2

枸櫞酸鹽利用試驗的方法將待檢菌接種于含有枸櫞酸鹽和銨鹽的西蒙和柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h后，觀察結果。

枸櫞酸鹽利用試驗的結果判斷培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{色者為陽性。培養(yǎng)基中無菌生長、仍為綠色者為陰性。。+-12-3

枸櫞酸鹽利用試驗的應用應用：主要用于腸桿菌科屬間的鑒別。沙門菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬等通常為陽性。埃希菌屬、志賀菌屬等為陰性。12-4丙二酸鹽利用試驗13

丙二酸鹽利用試驗的原理某些細菌可利用丙二酸鹽作為唯一的碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。13-113-2

丙二酸鹽利用試驗的方法將待檢菌接種到丙二酸鹽培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)后觀察結果。13-3

丙二酸鹽利用試驗的結果判斷與應用結果：培養(yǎng)基由綠色變成深藍色為陽性培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮詰茫褐饕糜谀c桿菌科細菌屬間的鑒別，克雷伯菌屬為陽性。觸酶（過氧化氫酶）試驗14有觸酶的細菌能催化過氧化氫生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。14-1觸酶（過氧化氫酶）試驗的原理玻片法：用接種環(huán)取備檢菌少許，置于潔凈的玻片上，滴加3%的過氧化氫1～2滴，觀察結果。試管法：用潔凈的玻棒蘸取待檢菌少許，置于裝有3%過氧化氫的試管內，觀察結果。14-2觸酶（過氧化氫酶）試驗的方法結果：一分鐘內產(chǎn)生大量氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。應用：用于革蘭陽性球菌初步分屬，葡萄球菌、微球菌為陽性，鏈球菌為陰性。14-3觸酶（過氧化氫酶）試驗的結果判斷與應用+

-氧化酶試驗1515-1氧化酶試驗的原理

某些細菌具有細胞色素氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化成紫紅色醌類化合物。濾紙法：用潔凈濾紙蘸取菌落，加一滴試劑，觀察結果。菌落法：直接在菌落上加試劑，觀察結果。紙片法：使用試劑浸泡制成的試劑紙片，取足夠的菌落，觀察結果15-2氧化酶試驗的方法濾紙法：陽性結果紙片法：陽性、陰性結果15-3氧化酶試驗的結果結果：陽性者立即出現(xiàn)紅色，繼而變?yōu)樯罴t色至深紫色。陰性者不變色。15-4氧化酶試驗的應用主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。血漿凝固酶試驗16有些細菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可以使人和動物血漿中的纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，從而使血漿凝固。結合凝固酶——存在于細胞壁上——玻片法游離凝固酶——分泌菌體外——試管法16-1血漿凝固酶試驗的原理方法1：玻片法：取潔凈玻片一張，加生理鹽水兩小滴于玻片兩端，用接種環(huán)挑取待檢菌落和對照菌均勻涂于鹽水中，制成濃菌液，加兔或人血漿一滴于菌液中，觀察結果。

16-2血漿凝固酶試驗的方法方法2：試管法：于3支試管中分別加入1:4稀釋的血漿0.5ml，1支管加入待檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml,另兩支分別加陰陽性對照菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml，35℃培養(yǎng)3～4h后觀察結果。16-2

血漿凝固酶試驗的方法16-3

血漿凝固酶試驗的結果判斷結果：16-4血漿凝固酶試驗的應用應用：

主要用于葡萄球菌的鑒定1：血漿2：生理鹽水16-4血漿凝固酶試驗的應用應用：

主要用于葡萄球菌的鑒定1231：凝固酶陰性對照菌株2：凝固酶陽性對照菌株3：待檢菌硝酸鹽還原試驗17某些細菌能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸，再與α-萘胺結合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(紅色化合物)。17-1硝酸鹽還原試驗的原理硝酸鹽亞硝酸鹽還原亞硝酸+醋酸重氮磺酸甲液N-α-萘胺偶氮苯磺酸（紅色化合物）乙液方法：

取將被檢細菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24小時，加入甲液（對氨基苯磺酸0.8g、5mol／L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g、5mol／L、醋酸100ml）等量混合液，觀察結果。結果：紅色：為陽性無色：進一步鑒定硝酸鹽還原試驗的結果判斷-+17-2硝酸鹽還原試驗的應用無色+鋅粉→無色：陽性無色+鋅粉→紅色：陰性原理：鋅離子能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，加入鋅粉后變成紅色，表示有剩余的硝酸鹽存在，證明為真陰性反應。應用：有助于鑒別腸桿菌科、嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、布蘭漢菌屬、假單胞菌屬等。17-3膽汁溶菌試驗18肺炎鏈球菌能產(chǎn)生自溶酶，一般培養(yǎng)24小時后菌體可以發(fā)生自溶，自溶酶可以被膽汁所激活加速細菌的自溶速度使菌體自溶消失。18-1膽汁溶菌試驗的原理平板法：取膽酸鈉溶液一環(huán)，放在平板的菌落上，35℃30min觀察結果。試管法：于0.9ml培養(yǎng)了18～24小時的菌液中，加入取氧膽酸鈉試劑0.1ml或牛膽鹽0.2ml混勻，37℃水浴10～30min，觀察結果。

18-2膽汁溶菌試驗的方法18-3

膽汁溶菌試驗的結果判斷與應用結果：平板法：菌落消失者為陽性。試管法：加膽鹽的菌液變透明，對照管仍混濁，判為陽性。應用：主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。加膽鹽加生理鹽水+-CAMP試驗19