核酸雜交檢測技術(shù)

核酸雜交檢測技術(shù)核酸雜交技術(shù)是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，近年來正逐漸用于病毒病的特異、敏感和快速診斷。雜交的基本原理是堿基互補的二條單鏈核酸退火形成雙鏈。用于診斷目的的雜交雙方是已知序列的病毒探針和待測樣品中的病毒核酸，雜交后通過特定方法檢測。如有雜交信號，則說明樣品中存在病毒核酸，進(jìn)而證明病毒感染的存在?？诖郎y的病毒核酸可以從病料中提取，也可以從純化的病毒粒子提取。提取后可在膜上與探針雜交（固相雜交）?；蛑苯釉谠嚬艿碾s交液中雜交（液相雜交），此外，也可直接在組織切片或細(xì)胞涂片上對細(xì)胞中的病毒核酸進(jìn)行雜交（原位雜交）。下面重點介紹如何建立雜交體系及適用于病毒診斷的幾種雜交方法?？诳冢ㄒ唬┙㈦s交體系□□核酸雜交是多種環(huán)境因素與二條互補核酸鏈綜合作用的結(jié)果,它有較高的技術(shù)要求。了解各種組份及反應(yīng)條件對雜交的影響是建立雜交體系，獲得理想結(jié)果的基礎(chǔ)?？?、溫度口雜交反應(yīng)中，雙鏈核酸的變性與復(fù)性主要是溫度控制的。選擇適當(dāng)?shù)碾s交和洗膜溫度是實驗成敗最關(guān)鍵的因素之一。雜交反應(yīng)通常在低于解鏈溫度（T□m值）15?25°C的條件下進(jìn)行。T□m值受核酸鏈組成（G+C）、溶液的離子強度、pH值及反應(yīng)體系是否含變性劑等的影響。在雜交體系不含變性劑的情況下,DNA之間的雜交反應(yīng)通常在68C進(jìn)行，當(dāng)含50%變性劑甲酰胺，則在42C進(jìn)行?？?、pH值□雜交體系的pH在5?9的范圍內(nèi)對復(fù)性無明顯影響。雜交反應(yīng)通常在pH6□5?7□5之間進(jìn)行。較高的pH值產(chǎn)生更嚴(yán)格的雜交條件?？?、鹽離子濃度口體系中往往加入單價離子的鹽，因為單價陽離子與核酸鏈上的磷酸基團發(fā)生靜電反應(yīng)，所以能降低核酸鏈之間的靜電排斥，維持雙鏈DNA的穩(wěn)定性。鹽濃度增加，穩(wěn)定性提高。雜交體系中通常采用6倍SSC（1倍SSC為0□15mol/LNaCl和0口015mol/L檸檬酸鈉，pH7□0）緩沖液。口4、變性劑□雜交體系中加入變性劑可降低T□m值，所以雜交可在更低的溫度下進(jìn)行。常用變性劑是甲酰胺?？?、DNA濃度□濃度愈高,復(fù)性速度愈快。所以雜交反應(yīng)中應(yīng)加入足夠的探針，還應(yīng)盡量減少雜交體積，一般每百cm□2濾膜用2□5ml雜交液。口6、探針長度□溶液中DNA復(fù)性率與片段長度的平方根成正比。所以用長的探針可獲得高的復(fù)性率。但原位雜交通常用較短的探針，以減少探針進(jìn)入細(xì)胞并擴散到靶核酸的阻力?？?、硫酸葡聚糖口在水溶液中，此化合物表面可吸附DNA探針分子,從而濃縮探針，促進(jìn)二條核酸鏈間的締合。其10%的濃度可提高雜交速度10?100倍。使用硫酸葡聚糖可能導(dǎo)致背景加深，所以一般在探針濃度過低的情況下才使用?？?、雜交時間□它受探針的長度與濃度、反應(yīng)體積等因素的影響，較短的探針、較高的探針濃度和較小的雜交體積,需要較短的雜交時間。一般來說，雜交時間通常在2?16小時?？?、預(yù)雜交□在雜交前進(jìn)行預(yù)雜交,封閉非特異的DNA結(jié)合位點，降低非特異雜交,是雜交的前提。常用的封阻試劑有非特異性的DNA（鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA）和大分子化合物（聚蔗糖、聚乙烯毗咯烷酮、牛血清白蛋白、脫脂奶粉等）。□10、堿基錯配口雜交中堿基錯配將明顯提高雜交本底，從而影響雜交結(jié)果的判定。因此雜交可在更為嚴(yán)格的條件下進(jìn)行,如低于T□m值15°C的溫度下雜交?？?1、漂洗口雜交后的漂洗是減少非特異雜交,降低本底的關(guān)鍵步驟。通常用較低鹽濃度（0□1倍SSC）的緩沖液在較高溫度下（如68C）漂洗雜交膜。口口（二）核酸打點雜交口口1、操作步驟□核酸打點雜交是最常用的一種雜交檢測方法，是作為診斷目的的首選方法。它是將一定量的病毒核酸（DNA或RNA）打點在固相支持膜（通常是硝酸纖維素膜或尼龍膜）上,然后與放射性或非放射性標(biāo)記的（DNA或RNA）探針進(jìn)行雜交，雜交后通過放射自顯影（檢測放射性探針）或顯色反應(yīng)（檢測非放射性探針）檢測雜交信號。陽性雜交信號表明病毒核酸的存在，檢測出病毒核酸就充分說明發(fā)生了病毒感染。具體操作方法如下：口①裁剪一張大小適度的硝酸纖維素膜（NC膜），將膜在去離子水中濕透（不能完全濕透的膜不宜使用），再置20倍SSC中浸泡30分鐘,然后置濾紙上，室溫晾干；口②取變性的病毒核酸（DNA或RNA）1?5“l(fā)點樣于上述處理的NC膜上，同時點上探針同源核酸（作為陽性對照）和非同源核酸（作為陰性對照）；口③室溫干燥后，將點樣的NC膜置80C干烤固定2小時；口④點樣膜用6倍SSC,0□1%十二烷基肌氨酸鈉,0□02%SDS,1%封阻試劑（一種特殊提純和處理的脫脂牛奶粉，柏林格公司生產(chǎn)）的預(yù)雜交液于68C預(yù)雜交4?6小時。每100cm□2膜用至少20ml預(yù)雜交液；口⑤將膜用雜交液（預(yù)雜交液中加入20?80ng/ml變性的探針）于68C雜交12?16小時。每100cm□2膜用2口5ml雜交液；口⑥室溫下用2倍SSC,0□1%SDS溶液洗膜2次，在68C條件下用0口1倍SSC,0□1%SDS溶液洗膜2次，每次15分鐘；口⑦如果進(jìn)行放射自顯影,則在室溫下用0口1倍SSC洗膜一次，室溫干燥后，進(jìn)行放射自顯影;如果進(jìn)行化學(xué)顯色，則進(jìn)行如下操作（以地高辛顯色為例）；口⑧用100mmol/LTris?HCl,pH7□5,150mmol/LNaCl短暫洗滌膜；口⑨100cm□2的膜在20ml抗體結(jié)合物溶液中室溫反應(yīng)30分鐘；口口10□重復(fù)⑧的洗滌二次，每次15分鐘；口口11口膜在暗中顯色，當(dāng)要求的點顯出顏色時，可用TE洗膜，終止反應(yīng)。口2、操作說明口（1）從感染的動物組織、血液、分泌物、糞便等樣品中提取的核酸經(jīng)變性后可直接點在NC膜上,檢測可能含有的病毒核酸；口（2）點樣量不超過5口l,如果樣品中核酸含量很低，可在上一次點樣干燥后在同一點重復(fù)點樣。也可用多孔抽濾加樣器進(jìn)行點樣，其點樣量可達(dá)200口l以上；口（3）除NC膜外，也可用尼龍膜載樣；口（4）樣品或探針是RNA時,所有試劑及用品均應(yīng)進(jìn)行無RNase處理,而且操作要嚴(yán)格,雜交后可以不必如此要求；□（5）預(yù)雜交液的配方多種多樣。作者經(jīng)驗表明，上述預(yù)雜交液容易配制，可用于放射性和非放射性標(biāo)記的DNA探針雜交?？凇酰ㄈ┖怂崦副Ｗo(hù)分析法□□該方法是近年來發(fā)展起來的一種新的RNA檢測方法。它基于一種液相雜交方法，即被檢測RNA鏈與均一分子的單鏈探針（放射性標(biāo)記）在試管中進(jìn)行雜交，然后用適當(dāng)?shù)膯捂満怂崦福⊿□1核酸酶,RNA酶A和T□1）水解掉未雜交的單鏈核酸，電泳分離后,通過放射自顯影檢測未被水解（被保護(hù)）的雙鏈雜交體。與Northern分析法相比,核酸酶保護(hù)分析法不需要固相支持膜,所以操作簡便，雜交質(zhì)量也不受RNA轉(zhuǎn)移效率和洗膜條件的影響，而且信/噪比大大提高，其檢測的靈敏度比前者提高10倍以上。此外，還能精確定量被檢RNA。核酸酶保護(hù)分析法對RNA樣品的純度和完整性要求不高,樣品可以用細(xì)胞總RNA,即使輕度降解，也不影響檢測結(jié)果。采用的探針通常是單鏈的、但必須完全均一的DNA或RNA分子。單鏈DNA探針通常采用M□□13口噬菌體系統(tǒng)，摻入同位素標(biāo)記的一種dNTP來制備，或者采用末端標(biāo)記來制備。RNA探針一般采用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，摻入同位素標(biāo)記的一種rNTP來制備（如前所述）?！?、RNA酶保護(hù)分析法（RNaseprotectionassay,RPA）□本方法所采用的探針是單鏈RNA,它比DNA/RNA雜交體穩(wěn)定得多。雜交后加入適量RNA酶A和T□1,它們專一性地水解未形成雜交體的單鏈RNA,而探針與被檢RNA雜交后形成的雙鏈RNA則被保護(hù)，電泳分離后,通過放射自顯影顯示雜交信號。此方法甚為敏感，可以檢測每個細(xì)胞中1?5個RNA拷貝。操作過程如下：口①取5plRNA樣品（含量取決于被檢RNA的豐度，可0口5?150日g）,置冰??；口②加入25pl雜交液（80%去離子化甲酰胺,0□4mol/LNaCl,40mmol/LPIPES,pH6□4,1mmol/LEDTA,pH8口5）稀釋的同位素標(biāo)記RNA探針（約1X10□5cpm）,混勻并離心；口③95°C變性3分鐘后立即置42C?50C水浴中雜交過夜（12?16hr）；□④加入300plRNA酶消化液（300mmol/L酶A）,于37°C溫育30分鐘；口⑤加20pl10%SDS,10pl10mg/ml蛋白酶K,于37°C溫育30分鐘；口⑥加2日l10mg/ml酵母tRNA;□⑦酚/氯仿抽提,乙醇沉淀，用10口l電泳上樣液（80%甲酰胺，10mmol/LEDTA,pH8□0,0□1%二甲苯蘭FF,0□1%漠酚蘭）溶解；口⑧95C變性3?5分鐘，立即冰浴。于適當(dāng)濃度的8mol/L尿素變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。最后放射自顯影，判定結(jié)果?？?、S□1核酸酶保護(hù)分析法□此方法類似于RPA,只是所用的探針是單鏈DNA（一般不用雙鏈DNA探針）；所用的酶是S□1核酸酶，它能降解單鏈DNA或RNA,而RNA/DNA雜交體則被保護(hù)，操作過程如下：口①取0口5?150ng樣品RNA,乙醇沉淀后，重溶于30pl雜交液（見RPA）;□②加入1X10□5cpm單鏈DNA探針；口④95C變性3分鐘,立即置52C水浴過夜；口③加入300日l冰預(yù)冷的S口1核酸酶溶液（0□28mol/LNaCl,0□05mol/L乙酸鈉,pH4□5,4□5mmol/LZnSO□4,1000單位/mlS□1核酸酶）,37C水浴30分鐘；口⑤加入75pl終止液（2□5mol/L乙酸胺，50mmol/LEDTA）,2pl10mg/ml酵母RNA；口⑥乙醇沉淀，用10pl上述電泳上樣液溶解，95C變性3分鐘，立即冰浴；口⑦如上述電泳和放射自顯影?？诳冢ㄋ模┖怂嵩浑s交□□所謂原位雜交，就是保持組織與細(xì)胞形態(tài)的完整性,用核酸探針直接檢測細(xì)胞內(nèi)的靶核酸序列。它可以檢測和精確定位胞漿內(nèi)或細(xì)胞器上，胞核內(nèi)或染色體上的各種靶核酸序列。該方法不需要從組織細(xì)胞中提取核酸，對細(xì)胞中含量極低的靶序列有較高的敏感性?？谠浑s交是可以用于病毒感染檢測的另一方法。它能檢測細(xì)胞中病毒核酸的復(fù)制與表達(dá)以及病毒的傳播，并對細(xì)胞中的病毒核酸進(jìn)行定位;它能鑒定感染細(xì)胞中病毒基因的整合以及染色體上的整合位點。應(yīng)用該方法，還能檢測持續(xù)感染個體中何種組織含有病毒。口除了必須對組織細(xì)胞進(jìn)行固定，以保持原來的形態(tài)外，原位雜交與普通雜交方法沒有大的區(qū)別。對組織細(xì)胞固定的好壞直接影響雜交的效果，所以用于核酸原位雜交的固定液必須:①理化性質(zhì)穩(wěn)定;②能很好保持細(xì)胞形態(tài)的完整;③對核酸無修飾和降解作用，并維持其在細(xì)胞內(nèi)的定位;④不阻礙探針與靶核酸的雜交,不引起雜交本底過高。符合此條件的理想的固定液有10%甲醛、4%多聚甲醛、戊二醛和乙醇/冰乙酸（3：1）等，其中4%多聚甲醛最為常用。病毒單鏈RNA原位雜交的基本方法如下：□①將組織切片附于清潔的無核酸酶污染的載玻片上，或取2?3滴分散的細(xì)胞懸液直接滴于載玻片上，室溫干燥；口②用4%新鮮配制的多聚甲醛（PBS配）室溫下固定20分鐘,PBS洗二次；口③不同濃度(30%,60%,80%,95%,100%)乙醇梯度脫水，切片或涂片置于100%乙醇中，-20°C保存?zhèn)溆?；口④用川g/ml蛋白酶K(溶于0口1mol/LTris?HCl,pH8口0,50mmol/LEDTA),于37°C消化30分鐘,滅菌去離子