損傷修復(fù)與誘變育種

關(guān)于損傷修復(fù)與誘變育種第1頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2直接修復(fù)：光復(fù)活修復(fù)，轉(zhuǎn)甲基酶，插入酶堿基錯(cuò)配修復(fù)：甲基化引導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)切除修復(fù)：UvrABC,Ap切除修復(fù)，糖基化酶切除修復(fù)GO系統(tǒng)重組修復(fù):

同源重組SOS修復(fù)鏈交聯(lián)的修復(fù)鏈斷裂的修復(fù)第四節(jié)DNA損傷的修復(fù)機(jī)制第2頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3第五節(jié)突變過程與誘變育種技術(shù)回復(fù)突變與抑制突變誘發(fā)突變的過程誘變育種的主要流程誘變育種中需要注意的幾個(gè)問題第3頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4一回復(fù)突變與抑制突變表型回復(fù)為野生型，可能是真正的回復(fù)突變（backmutation)

產(chǎn)生的，也可能是發(fā)生了抑制突變?cè)斐傻?。抑制突變?/p>

suppressormutation）抵消或抑制了前一次突變的表型效應(yīng)第4頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5區(qū)分回復(fù)突變與抑制突變的方法第5頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6抑制突變的特點(diǎn)如下：(1)抑制突變是在第一次突變不同位點(diǎn)將它抵消的。因此原來的突變可以通過野生型和回復(fù)突變型之間的雜交又恢復(fù)為突變型；

(2)抑制突變可能發(fā)生相同的基因中，抑制原來的突變，稱基因內(nèi)抑制，或發(fā)生在不同的基因中稱基因間抑制。

(3)不同的抑制突變其作用方式不同。如有的抑制是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，有的可能是通過細(xì)胞生理功能來實(shí)現(xiàn)。第6頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月71基因內(nèi)抑制第7頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月8LeuBS286MLeuB3(β)-異丙基蘋果酸脫氫酶,作用于亮氨酸生物合成的第二步LeuBS286L第8頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9LeuBS286VLeuBS286LL308P第9頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月10第10頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月11野生型蛋白X軸切面電勢(shì)分布S286V沿X軸切面電勢(shì)分布S286L沿X軸切面電勢(shì)分布S286LL308PS286LS286S第11頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12假定某一基因突變使一種蛋白質(zhì)變?yōu)槿菀诪榱硪晃镔|(zhì)所抑制，因而使野生型表型不能出現(xiàn)，再假定另一基因發(fā)生突變后這抑制物不再產(chǎn)生，那么后一突變基因便是前一突變基因的抑制基因。假定某一突變基因使某一代謝產(chǎn)物不能形成，再假定另一突變基因使同一代謝產(chǎn)物由另一途徑合成，那么它也是前一突變基因的抑制基因。如果某一代謝中間產(chǎn)物具有某種表型效應(yīng)，假定第一個(gè)突變基因中斷了這一中間產(chǎn)物以后的代謝途徑而使中間產(chǎn)物積累，再假定另一突變基因使中間產(chǎn)物出現(xiàn)以前的代謝途徑中斷，那么它也成為前一突變基因的抑制基因。2基因間抑制——代謝補(bǔ)償?shù)?2頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月13例1粗糙脈孢菌的腺嘌呤缺陷型(ade)突變35203產(chǎn)生一種由腺核苷酸合成的代謝中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變來的紫色色素。在這一基因不發(fā)生回復(fù)突變的情況下，另外三個(gè)腺嘌呤缺陷型27663、28610、44411中的任何一個(gè)都抑制紫色色素的產(chǎn)生而恢復(fù)了野生型的不產(chǎn)色素這一性狀。對(duì)于突變型35203的產(chǎn)生紫色色素這一性狀來講,突變基因27663、28610、44411都是它的抑制基因。第13頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月14例2精氨酸的滲漏突變是嘧啶缺陷的抑制突變第14頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月152基因間抑制——校正tRNA突變抑制基因（suppressor）或稱校正基因

無義抑制（nonsensesuppressor）

錯(cuò)義抑制

(missensesuppressor)tRNA反密碼子的突變tRNA其它結(jié)構(gòu)的改變第15頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月16第16頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月17第17頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月18氨基酰tRNA合成酶對(duì)tRNA和氨基酸兩者具有專一性，它對(duì)氨基酸的識(shí)別特異性很高，而對(duì)tRNA識(shí)別的特異性較低。按照一般原理，酶和底物的正確結(jié)合是由二者相嵌的幾何形狀所決定的，只有適合的氨基酸和適合的tRNA進(jìn)入合成酶的相應(yīng)位點(diǎn)，才能合成正確的氨酰基tRNA?，F(xiàn)已經(jīng)知道合成酶與L形tRNA的內(nèi)側(cè)面結(jié)合，結(jié)合點(diǎn)包括接近臂，DHU臂和反密碼子臂。第18頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月19無義抑制第19頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20第20頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月21錯(cuò)義抑制第21頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月22tRNA基因造成的抑制突變的特點(diǎn):1.不是所有抑制基因都能產(chǎn)生有功能的蛋白質(zhì)，關(guān)鍵是要看氨基酸取代的情況。

2.校正的作用不可能是完全的。①校正的tRNA分子是有限的而且還要和釋放因子競(jìng)爭(zhēng)；②若是錯(cuò)義抑制的話，由于氨基酸發(fā)生取代,使得蛋白質(zhì)的活性有所降低。

3.每種抑制tRNA一般都只識(shí)別UAG終止密碼子，而不再識(shí)別原來相應(yīng)的密碼子。第22頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月234.赭石突變抑制基因不僅可以識(shí)別赭石密碼子（UUA），也可以抑制琥珀（Am）密碼子UAG。但反過來Am抑制基因（CUA）就不能抑制赭石突變（UAA），這是由于擺動(dòng)緣故所造成。5.當(dāng)細(xì)胞中含有多個(gè)tRNA拷貝時(shí)，抑制才能發(fā)揮作用。6.有的抑制基因，不僅可以識(shí)別終止密碼子，而且還可以識(shí)別原來的密碼子。如野生型tRNATrp的反密碼子是CCA，它可以識(shí)別原來的密碼子UGG，而且還可以識(shí)別終止密碼子UGA。第23頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月247.校正基因一般不會(huì)影響正常的終止(1)校正基因識(shí)別的終止密碼子不一定和正常終止的密碼子相同。有時(shí)正常終止位點(diǎn)有兩個(gè)連續(xù)的終止密碼子，而且結(jié)構(gòu)不同，如UAG-UAA；(2)釋放因子將和抑制基因競(jìng)爭(zhēng)和終止密碼子的結(jié)合；(3)抑制基因的效率很低，通常為1~5%，所以常不會(huì)抑制正常終止。第24頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月25二誘發(fā)突變的生物學(xué)過程第一階段誘變劑接觸DNA分子之前

進(jìn)入細(xì)胞－－細(xì)胞表面屏障作用穿過細(xì)胞質(zhì)，失活或增加活性細(xì)胞的生理狀態(tài)（復(fù)制轉(zhuǎn)錄態(tài)）第二階段從前突變到突變

DNA分子上的損傷，突變產(chǎn)生（經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)對(duì)損傷DNA的修復(fù)，抑制基因作用）第三階段基因突變到突變表型

表型遲延（phenotypiclag)生理性遲延和遺傳性遲延第25頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月26Phenotypiclag表型遲延分離性遲延（Segregationallag）

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，而突變通常發(fā)生在一個(gè)核上，包含突變的變異細(xì)胞必須經(jīng)過多代細(xì)胞分離后，由雜和狀態(tài)變?yōu)榧兒蜖顟B(tài)，才有可能表現(xiàn)突變表型。生理性遲延Physiologicallag

變異細(xì)胞變?yōu)榧兒蜖顟B(tài)后，在雜和期由正?；蛩纬傻牡鞍祝福┤匀话l(fā)揮作用，必須經(jīng)過多代細(xì)胞分離后，才能將這些非變異的蛋白（酶）稀釋掉，最終表現(xiàn)出突變的表型。第26頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月27誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。三誘變育種第27頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月28誘變育種

誘變

+篩選

誘變是隨機(jī)的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株都是經(jīng)過突變改造過的。第28頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月29誘變育種的基本過程—小概率事件第29頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月30誘變育種的基本過程選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)第30頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月31誘變劑選擇誘變劑量選擇平板篩選技術(shù)第31頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月321出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株：用來進(jìn)行育種處理的起始菌株◆出發(fā)菌株應(yīng)具備

①對(duì)誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株：

③已歷經(jīng)多次育種處理的菌株：第32頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月33制備單細(xì)胞或單孢子懸液

要求①菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，孢子初萌發(fā)

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，

方法①玻璃珠打散10-15min;

②加吐溫80或Tritonx-100

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：物理誘變劑——生理鹽水，磷酸緩沖液

化學(xué)誘變劑——特定的緩沖液

濃度：細(xì)菌、放線菌＞108個(gè)/ml

霉菌、酵母菌＞106個(gè)/ml第33頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月342誘變劑

誘變劑的選擇誘變劑作用的普遍性：

選擇那些在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV，亞硝基胍（NTG），快中子等。

誘變劑的特異性：

經(jīng)驗(yàn)性：

如，四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，

青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．第34頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月35菌株的差異：（即使是同一菌）

A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株---用緩和誘變劑

B：遺傳性穩(wěn)定的菌株---首用強(qiáng)，后用緩。

考慮誘變機(jī)制：

UV嘧啶，

亞硝酸

嘌呤，因此復(fù)合作用為好

第35頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月36誘變劑劑量的選擇用90-99%殺菌劑量用50—85%的殺菌劑量，此時(shí)正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產(chǎn)菌株。

第36頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月37第37頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月38誘變劑的處理方法

誘變劑使用方式：

單一處理，

復(fù)合處理：

誘變處理?xiàng)l件：溫度（生長(zhǎng)溫度）

PH（緩沖劑），處理時(shí)間

誘變作用的終止：用解毒劑（終止緩沖液）、用水稀釋

第38頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月39第39頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月40誘變劑使用方法舉例------紫外線第40頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月41亞硝酸---緩沖液

終止液第41頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月42甲基磺酸乙酯（EMS）------母液，工作液，終止液（解毒液）第42頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月43復(fù)合誘變處理（示例）-------固體誘變第43頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月443突變株的篩選

中間培養(yǎng)基因型+

環(huán)境

表型

目的：克服表型遲延，使突變充分表達(dá)分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象

第44頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月45合適的篩選方法：

平皿快速檢測(cè)法（初篩）變色圈法

透明圈法

生長(zhǎng)圈法抑菌圈法

梯度平板法

搖瓶培養(yǎng)法（復(fù)篩）第45頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月46第46頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月47顯色圈第47頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月48透明圈第48頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月49抑菌圈第49頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月50抑菌圈第50頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月51生長(zhǎng)圈第51頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月52第一輪：

一個(gè)出發(fā)菌株→→→

選出200個(gè)菌株→→→

選出50株→→→選出5株誘變處理初篩

（每株1瓶）復(fù)篩（每株3-5瓶）

第二輪：

5個(gè)出發(fā)菌株→→→

→→

→

選出50株

→→

→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每株1瓶）（每株3-5瓶）復(fù)篩第52頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月53三類常見突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選

第53頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月54

產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）孢子懸液------誘變----適當(dāng)培養(yǎng)（表型遲延）-----

涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)----4-5天—

測(cè)定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----效價(jià)高菌

第54頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月55第55頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月56

高產(chǎn)菌株的初篩（抑菌圈法）。指示菌：黑曲霉As3.324；培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)。A為出發(fā)菌株。第56頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月57

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

第57頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月58ATCC25922在0.03125ug/ml的恩諾沙星制備的坡面平板上的菌苔、菌落第58頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月59第59頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月60營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選MM基本培養(yǎng)基SM補(bǔ)充培養(yǎng)基CM完全培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺陷型－＋＋野生型＋＋＋原養(yǎng)型＋＋＋第60頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月61基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）－

MinimumEssentialMediumMM

：—凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）＋—滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或半合成培養(yǎng)基。

補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplemental

medium,SM）X

—在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。

第61頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月62篩選步驟

野生型菌株

C-1：誘變處理

C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

C-3：檢出缺陷型

C-4：鑒定缺陷型第62頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月63C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

誘變后，仍存在大量的野生型，不利于分離（1）抗生素法野生型菌株在MM上生長(zhǎng)+青霉素—?dú)⑺溃牵?/p>

缺陷型菌株在MM上不生長(zhǎng)＋青霉素—-不殺死注意：使環(huán)境的滲透壓提高，避免細(xì)胞破裂?？股靥幚硗旰?，離心收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入低滲溶液制霉菌素法則適合于真菌（例如：酵母、霉菌），可與真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇作用，從而引起溶菌第63頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月64第64頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月65（2）菌絲過濾法

適于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：野生型基本培養(yǎng)基上發(fā)育成菌絲；缺陷型孢子不萌發(fā)可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。

第65頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月66第66頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月67檢出缺陷型逐個(gè)檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)給法第67頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月68逐個(gè)檢出法

（牙簽）第68頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月69影印檢出法

第69頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月70夾層培養(yǎng)法

第70頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月71限量補(bǔ)給法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),篩選氨基酸缺陷型

大菌落為野生型，小菌落的為缺陷型。第71頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月72鑒定缺陷型生長(zhǎng)譜法組合營(yíng)養(yǎng)物法組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法第72頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月73生長(zhǎng)譜法

斜面菌種-----生理鹽水洗下細(xì)胞------洗滌-----涂布（105個(gè)/皿）方法簡(jiǎn)便；回變和污染不影響結(jié)果測(cè)定物質(zhì)可為粉末或紙片第73頁(yè)，課件共80頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月74紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液

測(cè)定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測(cè)定是哪類物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進(jìn)一步確定是哪種具體化合