上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)課件 1、倪培華-分子診斷技術(shù)基本原理及常見方法

分子診斷技術(shù)基本原理及常見方法上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系倪培華分子診斷策略一般性檢出策略提供是否存在某種病原體感染完整性檢出策略分型耐藥性常用的分子生物檢測方法基因擴(kuò)增隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA重復(fù)序列PCR限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）核酸雜交DNA序列分析基因芯片……..§

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase

ChainReaction

,PCR)PCR反應(yīng)的特點對標(biāo)本的純度要求低特異性強(qiáng)靈敏度高

簡便、快速整個PCR操指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平作過程，從標(biāo)本處理、PCR擴(kuò)增到產(chǎn)物分析，可在4h內(nèi)完成全部實驗引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性DNA

粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板DNA體內(nèi)外復(fù)制PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制的步驟變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本組成其他DNA聚合模板酶引物脫氧核糖核苷酸30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of

No.

AmpliconCycles

CopiesofTarget1cycle=2

Amplicon122cycle

=4Amplicon3cycle

=8

Amplicon244cycle=16

Amplicon384165cycle

=

32

Amplicon5326cycle

=64

Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247cycle

=

128

AmpliconPCR擴(kuò)增過程圖示CYCLE

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA100%

EFFICIENCY

90%

EFFICIENCY

80%

EFFICIENCY

70%

EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER

1CYCLE45678326412825625478917032361319346111019835764314

100%=2.00x244190%

=1.90x80%

=1.80x70%

=1.70x7011920234358399095121011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9901,1572,0823,7486,74716,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466?

以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式?

以oligo(dT)作為引物，mRNA3’末端polyA尾與之互補?

以人工合成的隨機(jī)序列(6

bp)混合物作為引物引物的在線設(shè)計工具及免費軟件簡介WWW

GeneFisherhttp://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web

Primers/webprimers.htmlProject

DOPE2eractiva.de/NetPrimer/netprimer.htmlPrimers3http://primer3.ut.ee/設(shè)計沙眼衣原體引物（Chlamydiatrachomatis，CT）確定擬要研究的基因:CTGenbank中找到相應(yīng)的基因序列采用引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物的設(shè)計/確保引物的特異性，將設(shè)計好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast

中核實/5’AATGCAAATCGTTTCCTTGC3’5’CGGAATTGTGCATTTACGTG3’AATGCAAATCGTTTCCTTGCCGGAATTGTGCATTTACGTG§

實時熒光定量PCR(real-time

quantitative

PCR)實時熒光定量PCR的特點靈敏度高特異性強(qiáng)可直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量解決PCR污染問題自動化程度高、操作簡單常用的熒光定量PCR方法SYBR

Green

ITaqman水解探針分子信標(biāo)SYBR

GreenI

工作原理未結(jié)合的SYBRgreen

I?

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位?

只有與雙鏈DNA結(jié)合后受到激發(fā)的時候，可以發(fā)出綠色熒光SYBR

Green

ISYBRGreenI

工作原理靈敏度高,使用方便非特異性產(chǎn)物融解曲線TaqMan

ProbesFAMTETJOE熒光素淬滅劑TAMRAHEX與目標(biāo)序列互補TaqMan

探針的機(jī)理DNA聚合酶在延伸階段將探針切碎，使熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分開，于是熒光得以檢測TaqMan

Probes工作原理熒光基團(tuán)淬滅劑游離的探針光能量轉(zhuǎn)移另一波長的熒光Taq發(fā)出熒光光延伸時，Taq酶水解探針，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號Taq分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號3.002.502.001.501.000.500.00與模板數(shù)成正比固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比10

10

10432Threshold初始DNA量越多,

熒光達(dá)到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40Cycle起始模板的對數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的模板量定量PCR§

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly

amplified

polymorphic

DNA

,RAPD)

隨機(jī)合成8-12

bp寡核苷酸(多為10

bp)作為引物

低退火溫度PCR，使引物與模板DNA在可能有一或兩個堿基錯配的情況下結(jié)合形成擴(kuò)增產(chǎn)物

擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)一般為35-45

特征性帶型的出現(xiàn)取決于引物和模板的DNA序列，依照帶型可以進(jìn)行菌種鑒定及分型§

重復(fù)序列PCR（repetitive

sequence-based

PCR，Rep-PCR）

利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為靶序列進(jìn)行PCR

細(xì)菌菌株分型的重復(fù)序列有10多種

基因外重復(fù)回文序列（Rep）

腸細(xì)菌基因組間共有重復(fù)序列（ERIC）

在細(xì)菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的差異，而序列本身在進(jìn)化過程中又具有高度保守§

限制性片段長度多態(tài)性分析(restricted

fragment

length

polymorphism，RFLP)

限制性內(nèi)切酶在特定的核苷酸序列上將雙鏈DNA切割，進(jìn)行凝膠電泳，依片段大小不同將其分離

不同生物個體核苷酸序列可能存在差異，酶切位點也會隨之改變，產(chǎn)生的DNA片斷長度呈現(xiàn)多態(tài)性現(xiàn)象

傳統(tǒng)的RFLP方法是指基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，電泳分離后再結(jié)合Southern印跡雜交，應(yīng)用該方法可以構(gòu)建DNA指紋圖§

Southern

Blot§

DNA序列分析(DNA

sequencing)ddTTPDNA序列分析DNA鏈