上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)課件 14.NIPT實(shí)驗(yàn)室檢測及質(zhì)量控制（徐晨明）

NIPT實(shí)驗(yàn)室檢測及質(zhì)量控制徐晨明上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院NIPT介紹檢測技術(shù)流程檢測質(zhì)量控制質(zhì)量控制指標(biāo)傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查

一組生化、超聲指標(biāo)的組合評估，預(yù)測不良妊娠的風(fēng)險(xiǎn)（21三體、18三體、開放性神經(jīng)管缺陷）孕周檢測手段檢出率假陽率超聲，頸后透明帶82-87%5%11-13+6周掃描

(NTscan)傳統(tǒng)篩查方法

(Non-invasive)孕周檢測手段檢出率假陽率15–

20血清學(xué)篩查(Quad

screen)81%5%甲胎蛋白(AFP)絨毛膜促性腺激素(hCG)游離雌三醇

(uE3)抑制素A(InhibinA)同時結(jié)合孕婦的預(yù)產(chǎn)期、體重、年齡和采血時的孕周綜合評估計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測

Non-invasive

Prenatal

Testing

1997,胎兒游離DNA被發(fā)現(xiàn)

2003,人類基因組計(jì)劃完成

2005,二代測序技術(shù)

(NGS)

突破針對外周血中游離DNA直接進(jìn)行的無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查，近年來快速發(fā)展游離DNA發(fā)展史1947年外周血中發(fā)現(xiàn)游離DNA2011年NIPT1997年胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)臨床應(yīng)用1987年惡性腫瘤患者血漿中分離出游離2007年NIPT方法學(xué)的建立DNA（cf-DNA）將提取到的血漿／血清的DNA，用Y染色體特異性引物擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物凝膠電泳后觀察條帶。13、14號為男性基因組，陽性對照，15號為未懷孕女性基因組，16號為陰性對照。可見懷孕的女性血漿里可以檢測到男性胎兒的DNA胎兒游離DNA特點(diǎn)來源：

胎兒細(xì)胞通過胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒DNA殘留下來；

胎兒細(xì)胞凋亡；

胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡。基本特點(diǎn)：

含量有一定的變化規(guī)律。妊娠第5周開始可檢測到胎兒游離DNA，隨著孕周增加而增加，但存在個體差異；

分娩后短時間內(nèi)消失，平均半衰期為16.3min，2h后無法檢出；

DNA片段較小，平均166bp左右。Am.

J.

Hum.Genet.62:768–775,

1998不同的人的胎兒的濃度有個體的差異，但總體是隨孕周的增加而增加基于二代平臺的NIPT技術(shù)TargetedSequencingMassivelyParallelShotgun

SequencingTargetedSequencingNateraPanorama?SequenomMaterniT21TMIlluminaVerifi?BerryBAMBNITMBGINIFTYTMAriosaHarmonyTMCOUNTINGSNPs

定量法通過全基因組測序或目標(biāo)捕獲測序來檢測母血中目標(biāo)染色體在基因組中的比例是升高或降低，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對胎兒染色體非整倍體進(jìn)行評判

SNP法則通過分析母親、父親基因組和母血染色體中11000多個SNP位點(diǎn)的基因型和不同allele之間的比例，建立數(shù)學(xué)模型，并通過生物信息學(xué)方法計(jì)算概率，判斷胎兒非整倍體是否存在。部分文獻(xiàn)報(bào)道的NIPT對21三體的產(chǎn)前檢測論文陽性陰性Sensitivity

SpecificityChiuet

al(BMJ

2011)Sehnert

et

al(ClinChem

2011)Ehrich

etal(AJOG

2011)Palomaki

etal(Genet

Med

2011)Lau

et

al

(JMFNM

2012)Bianchi

et

al(OG

2012)8613392121131434100%100%100%98.6%100%100%100%100%100%100%100%100%97.9%100%99.7%99.8%100%100%100%100%99.9%100%99.9%100%410147176893650818404Sparks

et

al(AJOG)123Ashoor

et

al(AJOG

2012)Norton

et

al(AJOG

2012)Nicolaides

et

al(AJOG

2012)Danet

al(Prenat

Diag2012)Gilet

al(UOG2013)297288819391096297314311與傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查相比

cfDNA沒有漏檢T21，而傳統(tǒng)方法漏檢20%

降低了100倍的假陽性率

cfDNA在包括低危人群的整個人群中的檢測效率同樣好

T18和T13的假陽性率（0.01%和0.02%）極低NIPS可取代傳統(tǒng)篩查成為一線篩查技術(shù)Thefollowingprotocoloptionsarecurrentlyconsideredappropriate:

cfDNAscreeningasaprimarytestofferedtoallpregnantwomen.Thereisnowincreasingevidencetoshowthatthetestingcanalsobeappliedtowomenwithaveragerisk.“可以將NIPT技術(shù)作為一線篩查提供給所有的孕婦。”“越來越多的證據(jù)顯示該項(xiàng)檢測也可以提供給普通風(fēng)險(xiǎn)人群?！薄獓H產(chǎn)前診斷學(xué)會（ISPD）2015年最新立場聲明BennP,BorrellA,ChiuRWK,etal.PositionstatementfromtheChromosomeAbnormalityScreeningCommitteeonbehalfofthe

BoardoftheInternational

SocietyforPrenatalDiagnosis[J].Prenataldiagnosis,2015,35(8):725-734.檢測技術(shù)流程檢測技術(shù)流程樣本信息采集數(shù)據(jù)分析樣本接收上機(jī)測序跟蹤回訪血漿分離DNA提取QC文庫檢測文庫構(gòu)建報(bào)告生成和發(fā)放血漿分離&DNA提取一步離心的缺陷全血4℃，1600g離心10min，取上清血漿轉(zhuǎn)速過低，游離DNA分離效率差出來過高的又會造成細(xì)胞破裂增加背景血漿4℃，16000g離心10min，取上清血漿文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建的目的是在需要測序的片段兩端加上能夠與測序儀配合的接頭序列，以進(jìn)行后續(xù)的測序常規(guī)步驟：基因組DNA抽提---超聲片段化DNA---DNA片段末端補(bǔ)平----；游離DNA:直接通過末端修復(fù)獲得兩端平齊的DNA不同的測序平臺加接頭的方式會有差異

如果是illumian的測序儀測序，末端修復(fù)后要通過在末端加個“A”堿基后再加接頭（因?yàn)閕llumian的接頭是末端是帶一個突出的“T”堿基），proton測序儀測序，末端修復(fù)后直接加接頭。

在加接頭的過程中可以加入標(biāo)簽，也可在pcr的過程再加入標(biāo)簽（一段長6～8bp、序列已知的短鏈DNA）從而產(chǎn)生一個可用于區(qū)分不同樣品的唯一編碼，測序結(jié)束后，通過軟件分析和篩選，即可從混合測序的結(jié)果中獲得每個不同樣品的測序結(jié)果。QC文庫檢測文庫質(zhì)量檢測常用的檢測儀：QPCR定量檢測儀：對文庫的濃度定量準(zhǔn)確，如果測序儀對濃度的容忍度低建議使用此定量方法，但是不能檢測片段長度。建議配合片段長度檢測儀一起使用。2100/2200生物分析儀：既可以檢測文庫的濃度又可以檢測文庫的片段長度。但文庫濃度定量沒有QPCR定量準(zhǔn)確。如果測序儀對濃度的容忍高建議使用此定量方法。2100檢測儀7500熒光定量PCR儀Qubit濃度檢測儀Qubit濃度檢測儀：對文庫的濃度定量，濃度誤差大，成本較前兩種低。如果是熟練穩(wěn)定的建庫同時測序儀對濃度的容忍度高的，可以使用此種方法。QC文庫檢測

Hiseq

2000、Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq

x10等對上機(jī)濃度容忍度低的測序儀建議要用QPCR定量儀定量

對于小RNA建庫，外顯子捕獲測序，全基因組測序的文庫建議要用2100/2200來確定建庫后文庫片段的大小

由于血漿游離DNA本來就是小片段的DNA，而且proton對上機(jī)的濃度的容忍度比較高，所以無創(chuàng)建庫樣本可以直接用qubit進(jìn)行定量。SBS測序技術(shù)上機(jī)測序SBS測序技術(shù)通過橋式PCR的方式對文庫進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后樣本通過測序過程中加入的堿基所帶的熒光的不同，經(jīng)拍照記錄顏色的不同來判斷堿基的差異。上機(jī)測序半導(dǎo)體測序半導(dǎo)體測序是通過模板珠實(shí)現(xiàn)，而模板珠是落入剛好能容納一個珠子的微孔中進(jìn)行反應(yīng)的。測序時聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)，期間每一個反應(yīng)階段加入一種堿基，一旦加入的堿基可以進(jìn)行聚合反應(yīng)，即釋放出氫離子，使孔槽內(nèi)的PH值產(chǎn)生變化數(shù)據(jù)分析以21-三體為例，假設(shè)：100DNA單位

/毫升血漿。其中,95個單位來源于母親,

5個單位來源于胎兒通過大規(guī)模并行測序,獲得分布在每條染色體上的真實(shí)的核酸片段數(shù)量,經(jīng)過計(jì)數(shù)與比較:

正常胎兒或者

21-三體胎兒報(bào)告生成和發(fā)放報(bào)告內(nèi)容：21,18,13三體風(fēng)險(xiǎn)評估建議：“高風(fēng)險(xiǎn)”的孕婦，須進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)前診斷，“低風(fēng)險(xiǎn)”的孕婦，需進(jìn)行后續(xù)隨診?！对袐D外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》檢測質(zhì)量控制檢測前唯一標(biāo)識、申請檢測的項(xiàng)目臨床信息檢測申請樣本采集采樣前準(zhǔn)備、采集信息收集（日期、樣本類型）、采血管、樣本體積≥5mL血漿：干冰、

cell

free

DNA采血管樣本運(yùn)輸及保存標(biāo)本接收全血

：常溫接收標(biāo)準(zhǔn)、拒收；不合格樣本的記錄檢測申請適用人群不適用人群孕周<12＋0周血清學(xué)篩查顯示胎兒常見染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)值介于高風(fēng)險(xiǎn)切割值與1/1000之間的孕婦夫婦一方有明確染色體異常1年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、異體細(xì)胞治療等有介入性產(chǎn)前診斷禁忌證者（如先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、出血傾向、慢性病原體感染活動期、孕婦Rh陰性血型等）胎兒超聲檢查提示有結(jié)構(gòu)異常須進(jìn)行產(chǎn)前診斷有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風(fēng)險(xiǎn)孕期合并惡性腫瘤孕20+6周以上，錯過血清學(xué)篩查最佳時間，但要求評估21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征風(fēng)險(xiǎn)者醫(yī)師認(rèn)為有明顯影響結(jié)果準(zhǔn)確性的其他情形注：本標(biāo)準(zhǔn)選自衛(wèi)計(jì)委《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》檢測申請慎用人群有下列情形的孕婦進(jìn)行檢測時，檢測準(zhǔn)確性有一定程度下降，檢出效果尚不明確；或按有關(guān)規(guī)定應(yīng)建議其進(jìn)行產(chǎn)前診斷的情形。包括：（一）早、中孕期產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)。（二）預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲。（三）重度肥胖（體重指數(shù)>40）。（四）通過體外受精——胚胎移植方式受孕。（五）有染色體異常胎兒分娩史，但除外夫婦染色體異常的情形。（六）雙胎及多胎妊娠。（七）醫(yī)師認(rèn)為可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性的其他情形。注：本標(biāo)準(zhǔn)選自衛(wèi)計(jì)委《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》樣本采集編號要同采血管上一致采血管類型按照無菌操作要求，采取孕婦外周靜脈血應(yīng)當(dāng)仔細(xì)詢問孕婦基本情況、孕產(chǎn)史、本次妊娠情況、既往史和家族史等，如實(shí)、準(zhǔn)確、詳細(xì)填寫檢測申請單EDTA管采樣體積≧5mlCellfreeDNA管樣本運(yùn)輸及保存樣本體積樣本類型運(yùn)輸條件備注4℃下條件暫存，必須離體8小時內(nèi)4℃條件下進(jìn)行血漿分離。母體全血（EDTA管）5-10mL4℃采血管或送檢單上標(biāo)記抽血日期及時間。全血離體72小時內(nèi)

4℃條件下進(jìn)行血漿分離。母體全血（cell

freeDNA

采血管）5-10mL6-35℃環(huán)境下常溫運(yùn)輸血漿分離后短期（一周內(nèi)）可以在﹣20℃冰箱暫存，長期-80

℃條件保存；禁止將樣本置于室溫下放置，避免反復(fù)凍融。血漿≧2mL干冰標(biāo)本接收標(biāo)本拒收情況標(biāo)本采集不當(dāng)，如抗凝劑使用不正確、容器使用不正確、嚴(yán)重溶血或有血凝塊、采血管破裂或開蓋、標(biāo)本標(biāo)識不清等標(biāo)本未按照規(guī)定的溫度、時限等保存和運(yùn)輸檢測申請單填寫不完整溶血正常溶血血漿分離時須根據(jù)溶血情況對血漿進(jìn)行質(zhì)控，將血漿分為正常、微溶血、中度溶血、重度溶血，溶血樣本由于有核細(xì)胞破裂，使母體基因組DNA釋放到血漿，造成cffDNA的比例含量下降，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此溶血樣本需要重抽血。檢測中每個標(biāo)本有效數(shù)據(jù)量、唯一比對序列數(shù)目等均應(yīng)當(dāng)符合試劑說明書要求

；EDTA：8hCellfreeDNA：72h血漿標(biāo)本-70℃以下保存檢測質(zhì)量合格的標(biāo)本應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室結(jié)果判讀文庫構(gòu)建上機(jī)測序血漿分離DNA提取文庫質(zhì)控信息分析防止混樣及DNA污染文庫的片段大小和濃度要符合試劑說明書要求DNA提取和文庫構(gòu)建的過程中可以加入陰陽性對照來監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程的污染和最后的數(shù)據(jù)質(zhì)量文庫質(zhì)控文庫構(gòu)建完成后須根據(jù)文庫濃度和文庫片段大小和分布對文庫質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，不合格的文庫重新構(gòu)建半導(dǎo)體測序法文庫的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：2100定量質(zhì)控圖

主峰片段大小在245—265bp左右；引物二聚體、接頭二聚體濃度低于主峰濃度的5%及無拖尾現(xiàn)象；文庫最低濃度不應(yīng)低于0.1ng/ul

主峰片段大小300bp左右（因?yàn)閕llumian平臺的接頭大小和半導(dǎo)體測序法有差異所以和半引物和接頭二聚體污染導(dǎo)體的主峰大小有差異），在120bp無明顯引物二聚體，次峰（500bp）不能高于主峰高度的1/3；文庫濃度要大于1.4nmol文庫質(zhì)控次峰過高

建議檢查血漿是否溶血，溶血的情況常常會出現(xiàn)次峰過高的的情況

如有溶血建議重新采血，如無溶血建議重新建庫引物和接頭二聚體峰過高

建議重新純化文庫，然后再檢測看純化結(jié)果，一般經(jīng)過純化可以去除引物污染上機(jī)測序質(zhì)控測序完成后根據(jù)測序結(jié)果對測序做一個質(zhì)控，合格的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不合格的結(jié)果重新測序SBS測序法測序結(jié)果質(zhì)控：半導(dǎo)體測序法測序結(jié)果質(zhì)控：Template

QC:Mean

Read

Length:

>100bpSequencing

QC:Total

Reads：Key

Signal：>60M>50PF（通過質(zhì)控的cluster概率）>80%Q30（質(zhì)量值大于或等于錯誤率為0.1%以下的堿基所占比值）>80%Key

signal:模板平均信號強(qiáng)度，可以反映乳化pcr的效果數(shù)據(jù)分析質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析過程中會對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，合格的出報(bào)告，不合格的重新測序或者重新文庫構(gòu)建信息分析DataUsableDataAnalysisResult數(shù)據(jù)測序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)In-Run質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析質(zhì)控測序質(zhì)控質(zhì)控指標(biāo)Flow統(tǒng)計(jì)單位Run說明Flow標(biāo)準(zhǔn)260測序數(shù)Nomatch(M)Bases(G)meanLenQ20(%)Run[0,4]未能拆分到樣品所剩下的比對序列條數(shù)樣品原始比對序列堿基數(shù)SampleSampleSampleSample[0.20,2][100,125][75,88.5][5,15]樣品比對序列的平均長度比對序列測序質(zhì)量大于

的堿基占比20PCT(%)樣品拆分比率數(shù)據(jù)In-Run質(zhì)控質(zhì)控指標(biāo)UR_Mean(M)GC_Gap(%)統(tǒng)計(jì)單位說明標(biāo)準(zhǔn)>3RunRunRunRunRunRunRunRun樣品唯一比對序列條數(shù)的均值和

堿基含量波動范圍G

C[0,2]Fraction_Mean(%)Dup_Mean(%)Female_NumChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_Rate[7,15]樣品的胎兒濃度的均值重復(fù)序列占總比均值女胎樣品個數(shù)<16.8[2,8]131821號染色體的相對

值CV[0.97,1.10][0.96,1.06][1.04,1.18]號染色體的相對

值CVCV號染色體的相對

值數(shù)據(jù)分析質(zhì)控質(zhì)控指標(biāo)統(tǒng)計(jì)單位說明標(biāo)準(zhǔn)[-1,1][-1,1][-1,1][0.8,1.2][0.8,1.2][0.9,1.3]>5Chr13_T_meanChr18_T_meanChr21_T_meanChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_RateChr13_RF_NumChr18_RF_NumChr21_RF_NumRun131821號染色體

值均值TRun號染色體

值均值TRunT號染色體

值均值樣品

號染色體相對

值范圍SampleSampleSampleSampleSampleSample13CVCV樣品

號染色體相對

值范圍1821樣品

號染色體相對

值范圍CV樣品

號染色體參考數(shù)13樣品

號染色體參考數(shù)18樣品

號染色體參考數(shù)>521>5實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求無創(chuàng)產(chǎn)前檢測PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)及各區(qū)的環(huán)境要求紫外燈分

區(qū)主

要

功

能溫

度濕

度

壓

差試劑準(zhǔn)備區(qū)18-27℃30-70%+15PA試劑準(zhǔn)備、儲存與分裝標(biāo)本與文庫制備區(qū)血漿分離與提取，文庫構(gòu)建18-27℃30-70%+5PA必需文庫擴(kuò)增與檢測區(qū)文庫擴(kuò)增、質(zhì)檢與混合18-27℃30-70%-（pooling）5PA-15PA20-25℃40-60%測序區(qū)測序檢測有明確的分區(qū)，各個區(qū)要有獨(dú)立的通風(fēng)和空氣系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)室里物品和人員要單一流向。儀器及設(shè)備使用儀器及設(shè)備維護(hù)狀態(tài)標(biāo)識確認(rèn)正常